Histon Deasetilaz Inhibitörleri

Lizin asetiltransferazlar (KATs) hem histon hem de histon olmayan proteinler^11,2,3,4lizin kalıntılarının asetilasyon katalaz. Son araştırmalar KATs ve asetiltransferaz fonksiyonu katı tümör büyümesini teşvik edebilir ortaya koymaktadır^4,5,6,7,8,9. Örneğin, CREB bağlayıcı protein (CBP)/p kanser çok sayıda sinyal yollarını düzenleyen iki paralog KATs^{vardır 2,3}. CBP/ p iyi histon asetiltransferaz karakterize var (HAT) fonksiyonu ve histon katalize 3 Lizin 27 asetilasyon (H3K27ac)^2,4,5,10,11, aktif arttırıcılar için önemli bir belirteç, organizatör bölgeleri ve aktif gen transkripsiyon¹²,^13,,14. CBP/p, mitaşlar ve diğer transkripsiyon faktörlerinin asetilasyonu ile onkogenlerin transkripsiyonaktik tarafından katı tümörlerde pro-büyüme sinyal yolları için kritik ko-aktivatörler olarak hizmet^{vermektedir 4,9,15,16,17,18}. Tümör ilerlemesindeki rollerinden dolayı, CBP/p ve diğer KAT'ler onkojenik fonksiyonlarını engelleyen yeni inhibitörlerin gelişimi için araştırma altındadır^{4,5,6,7,8,9,18},^19,,20. A ve GNE CBP/p⁴için güçlü ve spesifik inhibitörleri geliştirmek için iki başarılı girişimleri temsil^,9. Ek inhibitörleri şu anda CBP/p ve diğer KATs için soruşturma altındadır.

Daha önce açıklanan KAT inhibitörlerinin (KATi) kalitesi sorgulanıyor, birçok inhibitör hedef etkileri ve kötü karakterizasyonu gösteren²¹. Bu nedenle, yeni ilaç adaylarının titiz karakterizasyonu ve doğrulanması yüksek kaliteli kimyasal probların geliştirilmesi için gereklidir. Burada özetlenen tarama için bir boru hattı oluşturan ve titizlikle potens ve yeni KATi özgüllüğü doğrulayan üç protokolleri, HAT fonksiyonu inhibe belirli bir odak ile (HATi) KATs. CBP/p ve inhibitörleri örnek olarak kullanılır, ancak bu protokoller HAT^fonksiyonu7 olan diğer KAT'lar için uyarlanabilir.

İlk protokol, kontrollü test tüpü reaksiyonunda saflaştırılmış rekombinant p ve histones kullanan in vitro histone asetilea (HAT) testidir. Bu testi gerçekleştirmek kolaydır, maliyet-etkindir, bileşikleri düşük iş ortamında taramak için kullanılabilir ve radyoaktif maddeler gerektirmez. Bu protokolde, rekombinant p kısa bir kuluçka döneminde histon kuyruklarında lizin asetilasyonunu katalizler ve histon asetilasyon düzeyleri standart immünoblotlama prosedürleri kullanılarak ölçülür. Enzimatik reaksiyon histon asetilasyonu azaltan bileşikleri taramak için CBP/p inhibitörlerinin varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, HAT tsay yeni bileşikler CBP / p için seçici olup olmadığını doğrulamak için pcaf gibi diğer saflaştırılmış KATs karşı faaliyetlerini değerlendirerek kullanılabilir. HAT tsay, basitliği, düşük maliyeti ve bir inhibitörün gücünü/seçiciliğini belirleme yeteneği nedeniyle yeni inhibitörleri araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Nitekim, bu protokol genellikle bir in vitro ekran^5,,¹⁰olarak literatürde kullanılır. Ancak, HAT testinde tanımlanan inhibitörler hücre kültüründe her zaman etkili değildir, çünkü bir test tüpü reaksiyonu yaşayan bir hücre sisteminden çok daha basittir. Bu nedenle, hücre kültürü deneylerinde inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır^22,23.

Boru hattındaki ikinci protokol Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) tetkiktir. Bu hücre bazlı test histon deasetilaz inhibitörleri kullanır (HDACi) bir HATi ile co-kuluçka önce kromatin histones hiperacetylate bir araç olarak²⁴. Bazal histon asetilasyon hücre kültüründe düşük olabilir, zor asetilasyonu artırmak için bir HDACi eklenmesi olmadan immünoblotting yoluyla probe yapmak. ChHAI tsay amacı HDAC inhibisyonu neden histon asetilasyon artışı zayıflatmak yeni HATi belirlemektir. Bu testin avantajları düşük maliyet, göreceli performans kolaylığı ve test tüpü HAT testi daha fizyolojik alaka sağlar kültür, hücrelerin kullanımı içerir. HAT testindeki benzer şekilde, bu protokol veri toplama için standart immünoblotlama kullanır.

HAT ve ChHAI tahlilleri, küresel histon asetilasyonu inhibe etmek için yeni bileşiklerin potens hakkında veri sağlamak, ancak bu bileşiklerin belirli genomik bölgelerde modifikasyonları nasıl etkilediği hakkında fikir vermez. Bu nedenle son protokol olan Chromatin İmmünopan-nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. ChIP protokolünde, kromatin DNA-protein etkileşimlerini korumak için çapraz bağlanır. Kromatin daha sonra hücrelerden çıkarılır ve DNA-protein kompleksi ilgi proteini için selektif immünoprebata uğrar (örn. H3K27ac'a özgü bir antikor kullanılır). DNA daha sonra saflaştırılır ve qPCR kullanılarak analiz edilir. Örneğin, ChIP-qPCR yeni bir HATi'nin siklin D1²⁵gibi bireysel onkojenlerde histon asetiyonu aşağı yasedip düzenlemedığını belirlemek için kullanılabilir. ChIP-qPCR alanında kullanılan yaygın bir teknik olmakla birlikte,^4,10,,26optimize etmek zor olabilir. Bu protokol, ChIP-qPCR yordamını gerçekleştirirken oluşabilecek olası tuzakları önlemek için ipuçları sağlar ve veriler üzerinde gerçekleştirilmesi gereken kalite kontrol denetimleri içerir.

Birlikte kullanıldığında, bu üç protokol leri sıkı karakterizasyonu ve roman HATi doğrulama sağlar. Ayrıca, bu yöntemler gerçekleştirmek kolay, nispeten ucuz ve küresel yanı sıra bölgesel histon asetilasyon veri sağlamak, çünkü birçok avantaj sunuyoruz.

1. In vitro HAT istif

1. Arabellek hazırlığı
   NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız.
   1. 5x teşbi arabellek ve 6x Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS) hazırlayın ve °C'de saklayın. Aliquot SDS 1 mL aliquots içinde.
   2. 10x SDS jel çalışan tampon ve 10x TBST hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   3. 1x transfer tamponu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
      DİkKAT: Bu protokolde kullanılan tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. SDS, DTT ve bromofenol mavisi toksiktir ve yutulmamalı, solunmamalı veya deriye veya gözlere maruz kalmamalıdır. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın. Lütfen tehlikeli kimyasallarla başa çıkmak için kimyasal bir duman başlığı kullanın.
2. HAT tepkisi
   NOT: Anakardik asit bilinen bir p inhibitörü^3'tur ve HAT analizinin yeni p inhibitörlerini nasıl tanımlayabileceğini göstermek için örnek olarak kullanılır. adım şeması için Ek Protokol(Şematik 1)bölümüne bakın.
   1. 0,2 mL PCR tüpte aşağıdaki enzimatik reaksiyonu hazırlayın: 2 μL 5x teşrif arabellek, 1 μL saflaştırılmış p (0,19 μg/μL), 1 μL anakardik asit (HATi) veya DMSO kontrolü 1x teşrafa ile seyreltilmiş ve 2 μL otoklavd ddH₂O. Pre-incubate karışımı 10 min sıcaklıkta bu karışımı. Daha sonra reaksiyona 3 μL μM Asetil-CoA ve 1 μL saflaştırılmış H ( g/μL) ekleyin.
   2. Tam reaksiyon karışımını 30 °C'de pcr termal döngüde 1 saat inkübedin.
   3. 6x SDS örnek tamponuna oranında 2-mercaptoetanol ekleyin.
   4. PCR termal döngücüden numuneleri çıkarın ve reaksiyon karışımına 2 μL 6x SDS (2-mercaptoetanol eklendi) ekleyin.
      DİkKAT: 2-mercaptoetanol toksiktir ve kimyasal bir duman kaputu içinde kullanılmalıdır. Doğru kullanım için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
   5. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneleri veya °C'de saklayın veya jel elektroforezi ve immünoblotlamayı aşağıda ayrıntılı olarak açıklanız.
3. Jel elektroforez ve immünolot
   NOT: Jel elektroforezi ve immünoblotting için bu standart²⁷ prosedür eğitimi adlarının nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılı bilgi için bakın. Ek bilgi burada bulunabilir^28,29,30,^31,,32,33.
   1. Pipet 10 μL numuneler (adım ) bir % degrade poliakrilamid jel kuyuları içine. Pipet 5 μL protein merdiveni olarak kuyulardan birine moleküler ağırlık referansı olarak. Jel tankı kullanarak jeli 90 dk için V'de çalıştırın.
   2. Jeli bir transfer tankı kullanarak 70 dk için V'de polivinilidendiride (PVDF) membrana aktarın.
   3. Membranı transfer cihazından çıkarın ve plastik bir kapiçine yerleştirin. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
   4. 1x TBST adım kaldırın. Membranı bir gecede seçilen bölgeye özgü asetil antikorları (örneğin, H3K18ac veya H3K27ac primer antikorlar 1x TBST'de %5 süt içeren seyreltme) ilave edin.
   5. Birincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
   6. 1x TBST ikincil antikor seyreltin (% 5 süt içeren) ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 1 saat için membran kuluçka.
   7. İkincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
   8. Membrandan 1x TBST drenaj. HRP substrat peroksit çözeltisi ve HRP substrat luminol çözeltisini oranında (her biri 1 mL) ve kombine çözeltinin 2 mL'sini membran yüzeyine karıştırın.
   9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca membran ile çözelti kuluçka.
   10. Membrandan fazla kemilüminesan substratı kağıt havluya boşaltın ve membranı x-ray kaset tutucunun içine plastik şal içine yerleştirin.
   11. X-Ray film işleme adanmış karanlık bir odaya taşıyın. Filmi membranın üzerine yerleştirerek ve kaseti 30 s'ye kapatarak membranı bir x-Ray filmine maruz bırakın.
       NOT: Film ile membran arasındaki temas süresi deneysel olarak belirlenmelidir. Güçlü sinyaller kısa pozlama (saniye) ve zayıf sinyaller daha uzun pozlama gerekebilir gerekir.
   12. X-Ray filmini kasetten çıkarın ve bir x-ray film işlemcisi üzerinden çalıştırarak filmi işlayın. X-Ray filminin nasıl işlenir?
   13. Membranı plastik sargıdan çıkarın ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 5 dk boyunca ddH₂O ile yıkayın.
   14. Membranı 0,2 M NaOH ile 5 dakika oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek kuluçkaya yatırın.
   15. Membranı ddH₂O ile 5 dk oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek yıkayın.
   16. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
   17. Bir sonraki birincil antikor seyreltmesini (örneğin, kullanılan ilk antikor H3K18ac ise H3K27ac için prob) ekleyin ve 4 °C'de bir gecede sallayın. Tüm antikor probları tamamlanana kadar adımlarını tekrarlayın.

2. ChHAI teşp

1. In vitro ilaç tedavileri ve asetitli histones analizi
   NOT: A güçlü ve iyi karakterize p HATi^2,4 . Bu inhibitör, hücre kültüründeki etkinliği ve özgüllüğü nedeniyle kalan tahlillerde kullanılacaktır. MS (Entinostat)²⁴ histon asetilasyon düzeylerini belirgin bir şekilde artıran ve standart immünoblotlama ile asetilasyon problarının daha kolay saptanmasını kolaylaştırmak için kullanılan bir HDACi'dir. Bkz. Ek Protokol (Şematik 2) adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için.
   1. Tohum MCF-7 hücreleri 12 iyi plaka ve hücrelerin hücre kültürü orta 1 mL içinde% biraraya büyümeye izin verir. Aşağıdaki deneysel tasarım için kuyuları işaretleyin: iyi 1: DMSO kontrolü (referans noktası); iyi 2: A (3 μM); iyi 3: A (10 μM); iyi 4: MS (3 μM); iyi 5: MS (3 μM) + A (3 μM); iyi 6: MS (3 μM) + A (10 μM).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için tam DMEM ortamı kullanın ve hücrelerin %5 CO₂ile 37 °C'de büyümesine izin verin. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
   2. Tohumlamadan sonra 24 saat, pipet 4 mL tam DMEM media steril 15 mL konik tüp. Pipet 2 μL MS (DMSO'da 6 mM) ile 4 mL orta son konsantrasyon için 3 μM MS
   3. Pipet 2 μL DMSO ile 4 mL orta ayrı steril 15 mL konik tüp.
      DMSO'nun doğru şekilde işlenmesi için lütfen güvenlik veri sayfasını kontrol edin. Bazı eldiven tipleri DMSO kullanımı için derecelendirilmez.
   4. Hücre kültürünü her kuyuya orta (adım ) halinde 3 μM MS kuyularından ve pipet 1 mL'den aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş MS atın.
   5. Hücre kültürünü her kuyuya seyreltilmiş DMSO'nun ve pipet 1 mL'sinden (adım ) aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş DMSO atın.
   6. MS'e maruz kalan hücrelerde asetitli histones birikimine izin vermek için hücreleri kuvöze ve kuluçkaya yatırın 4 saat (kuyu lar ).
      NOT: MS bir HDACi ve histon hiperasetilasyon neden olur²⁴. Bu 4 saat ön kuluçka MS a eklenmesinden önce hiperasetilasyon indüklemek için izin vermek için gereklidir, hangi histon asetilasyon azaltır^2,4.
   7. MS ile 4 saat kuluçkadan sonra, aşağıdaki seyreltmeleri ayrı steril 1,5 mL tüplerde pipetleme ile hazırlayın: μL DMSO ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A (20 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL MS (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A (6 mM) ve 0,5 μL MS (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A (20 mM) ve 0,5 μL MS (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam.
   8. Hücre kültürünün ortasını kuyulardan ve pipet 1 mL seyreltme 1'den 1'e, seyreltme 2'den 1'e, seyreltme 3'ten iyi ye 3'e, seyreltme 4'ten iyiye 4, seyreltme 5'ten iyi 5'e ve seyreltme 6'dan iyi 6'ya aspire edin.
      NOT: Genel bir kural, hücresel toksisite ve çoğalma değişikliklerini önlemek için hücre kültüründe %0,1 DMSO içeriğini geçmemek ve dmso (çözücü) içeriğini deneysel gruplar arasında dengelemektir.
   9. Hücreleri 20 saat boyunca kuvöze ve kültüre geri döndürün.
   10. 20 saat sonra hücre kültürünü kuyudan aspire edin.
   11. kuyuya 1 mL PBS boru tutarak hücreleri yıkayın. PBS'yi aspire edin.
   12. kuyularına μL 1x pasif lisis tamponu ekleyin (tablo 1'ebakınız). Hücrelerin dondurulması-çözülmesi ve pilisi için hücre kültür plakası (pasif lisis tamponunda örneklerle) bir gecede −80 °C'de saklayın.
       DİkKAT: Tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. CDTA ciddi göz hasarı ve tahrişe neden olabilir.
   13. 10 dakika boyunca hafif sallayarak oda sıcaklığında eritme örnekleri. Örnekleri 1,5 mL'lik tüpleri ayırın ve hemen buza yerleştirin.
   14. Her numunenin protein konsantrasyonu ölçün. Protein konsantrasyonu birkaç köklü protokoller kullanılarak belirlenebilir
   15. Protein konsantrasyonu (eşit hacimde) 1x pasif lisis tamponu kullanarak seyreltmek için, gerektiğinde protein konsantrasyonu dengeleyin.
   16. 6x SDS örnek tampon oranında 2-mercaptoethanol ekleyin.
   17. numunelere 2-mercaptoetanollü 6x SDS numune tamponu ekleyin ve 1x SDS numune tamponunun son konsantrasyonuna ekleyin.
   18. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneler °C veya °C'de adıma kadar saklanabilir.
   19. Pipet, % degrade liakrilamid jelde kuyulara numune için 30 μg protein içeren bir hacimdir. Protokol 1'de açıklanan protokole göre immünolotlama işlemini gerçekleştirin.

3. ChIP-qPCR

NOT: Aşağıdaki protokol p inhibitörleri için örnek olarak açıklanmıştır.

1. Arabellek hazırlığı
   NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız. ChIP protokolünün genel adımları (örn. tampon tarifleri, yıkama süreleri ve santrifüj süreleri) aşağıdaki modifiye edilip, üreticinin ticari olarak kullanılabilen bir kitin tavsiyelerinden (bkz. Malzeme Tablosu)ve^{literatürden 35,36}.
   1. ChIP seyreltme tamponu, çekirdek şişme tamponu, düşük tuz yıkama tamponu, yüksek tuz yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve TE tamponunu hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   2. Hazırlamak SDS lysis tampon, 10x glisin tampon ve ChIP elüsasyon tampon. Oda sıcaklığında saklayın.
      DİkKAT: Doğru kullanım sağlamak için tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin.
2. İlaç tedavisi
   NOT: adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için Ek Protokol(Şematik 3)bölümüne bakınız.
   1. İki 15 cm kültür tabaklarında TOHUM MCF-7 hücreleri ve tam DMEM orta 12 mL% 90 biraraya hücreleri büyümek. Aşağıdaki deneysel tasarım için yemekleri işaretleyin: Çanak 1: DMSO kontrolü (referans noktası); Çanak 2: A (3 μm).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için komple DMEM ortamı kullanın ve %5 CO₂ile 37 °C'de büyüyün. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
   2. Steril 15 mL konik boruda, pipet 12 mL DMEM media ve pipet 6 μL DMSO. İyi bir şekilde karıştırın.
   3. Ayrı bir steril 15 mL konik tüpte, 3 μM A'lik son konsantrasyonu elde etmek için 12 mL DMEM ortam ve 6 μL A (DMSO'da 6 mM) pipet. İyi bir şekilde karıştırın.
   4. Çanak 1 ve 2'den medyayı aspire edin.
   5. DMEM'deki seyreltilmiş DMSO'nun 12 mL'sini (adım ) Çanak 1'e ekleyin.
   6. DMEM'deki 3 μM A'in 12 mL'sini (adım ) Çanak 2'ye ekleyin.
   7. Hücre kültürü yemeklerini 24 saat boyunca kuvöze ve kuluçkaya yatırın.
3. Hücre fiksasyonu
   1. Pipet μL (mL başına 27,5 μL) tam ortama % 37 formaldehit ve yavaşça karıştırmak için plaka girdap.
      DİkKAT: Formaldehit toksiktir. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
   2. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
   3. Pipet 2 mL 10x glisin plaka ve karıştırmak için girdap.
   4. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
   5. Kuluçkadan sonra, buz üzerine tabakyerleştirin ve proteaz inhibitörü kokteyl bir aliquot çözültün.
   6. Adım 'de hazırlanan tamponları kullanarak hem DMSO hem de A numuneleri için aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
      1. Proteaz inhibitörü kokteylinin seyreltilmesi ile 2 mL PBS
      2. Proteaz inhibitörü kokteylinin seyreltilmesi ile 1 mL çekirdek şişme tamponu
      3. Proteaz inhibitörü kokteylinin seyreltilmesi ile 0,5 mL SDS lysis tampon
   7. Hücre kültürü tabaklarından medyayı aspire edin ve hücreleri 15 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
   8. Pilette 2 mL PBS proteaz inhibitörü kokteyli (adım ) ile hücre kültürü yemekleri. Hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak çözeltiye kaldırın.
   9. Hücre süspansiyonuna mikrosantrifüj tüpü aktarın. Gerekirse ek PBS ile kalan hücreleri toplayın.
   10. Hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 4 °C'de x g'de dönme tüpleri.
   11. Proteaz inhibitörü kokteyli (adım ) ile çekirdeklerin şişme tamponunun süpernatant ve pipet 1 mL'sini pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   12. Tüpleri x g 4 °C'de 5 dk ve pelet çekirdekleri için santrifüj edin.
   13. SDS lysis tamponunun süpernatant ve pipet mL'ini proteaz inhibitörü kokteyli (adım ) ile pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   14. Kromatin örneklerini °C'de adıma kadar saklayın veya hemen adıma geçin.
4. DNA sonication
   1. DMSO örneğinden (adım ) μL kromatini bir pipet (her biri μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
   2. A örneğinden (adım ) μL kromatini pipet (her biri μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
   3. Aşağıdaki sonicator ayarlarını kullanarak DNA'yı kabaca baz çifti parçalarına sonikle bakın: 'lik Peak Incident Power (W), %10'luk Görev Faktörü, Patlama başına Döngü ve 's tedavi süresi.
      NOT: Sonication ayarları modelleri arasında farklılık gösterebilir ve ayarları farklı hücre hatları için uygun parça boyutu elde etmek için ayarlanması gerekebilir.
   4. Sonication sonra buz üzerinde örnekleri tutun.
   5. Sonicated kromatini 1,5 mL'lik bir tüpe pipet ve santrifüj kullanarak x g'de 4 °C'de 10 dk için pelet enkazına aktarın.
   6. Pipet supernatant (sonicated kromatin içerir) yeni bir tüp ve enkaz atın. Sonicated kromatin °C'de saklanabilir.
5. Kromatin immünopresipite (ChIP)
   NOT: Adım 'teki IP gruplarının şeması için Ek Protokol(Şematik 3)bölümüne bakın.
   1. Adım 'dan DMSO ve A örnekleri için sonicated kromatin protein içeriğini ölçün. Protein içeriği köklü protokoller kullanılarak ölçülebilir³⁴.
      NOT: Basitlik için bu protokol protein içeriğinin eşit olduğunu varsayacak ve μL sonicated kromatin kullanılacaktır. Aksi takdirde, protein içeriği eşit hacimde tüm numuneler arasında dengelenebilir gerekir.
   2. Pipet μL DMSO sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler ( μL her). Toplam hacmi μL'ye kadar çıkarmak için her tüpe ChIP seyreltme tamponunun ( seyreltme içeren) pipet μL'si.
   3. Pipet μL A sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler ( μL her). Pipette μL ChIP seyreltme tamponu (proteaz inhibitörü kokteylinin seyreltilmesini içeren) her tüpe toplam hacmi °L'ye kadar getirin. Çözeltinin 5 μL'ini tüplerden çıkarın ve °C'de A Girişi olarak saklayın.
   4. Bir pipet kullanarak, DMSO ve A örnekleri için ilgili tüplere immünopresipitasyon (IP) antikor (örn. spesifik olmayan IgG kontrolü veya H3K27ac spesifik antikor) ekleyin: IGG antikorlu IP #1 DMSO kromatini ( μg); IP #2 H3K27ac antikorlu DMSO kromatin ( μg); IP #3 IgG antikorlu A kromatin ( μg); IP #4 H3K27ac antikorlu A kromatin ( μg).
   5. Her tüpe 20 μL protein ekleyin Bir manyetik boncuk ekleyin. Boncukların tekrar askıya alındıklarının iyi bir şekilde askıya alınmasından emin olun.
   6. Numuneleri bir gecede 4 °C'de döndürün.
   7. Pelet protein Manyetik ayırıcı kullanarak manyetik boncuklar ve supernatant kaldırın. Boncukları rahatsız etmeyin.
   8. Boncukları μL ile 1 mL arasında düşük tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
   9. Boncukları μL ile 1 mL arasında yüksek tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
   10. Boncukları μL ile 1 mL arasında LiCl yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
   11. Boncukları μL ile 1 mL TE tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın. Adım kadar TE tampon boncuk tutun.
   12. Giriş örneklerini (adım ve )'den) dondurucudan çıkarın ve buzda tutun.
   13. Proteinaz K'nin bir aliquot'unu erit.
   14. Manyetik ayırıcı kullanarak boncukları peletve boncuklardan TE tamponu çıkarın (adım ).
   15. Giriş örnekleri de dahil olmak üzere her numuneye μL ChIP elüsyon tamponu + 1 μL Proteinaz K ekleyin. Bir termocycler kullanarak 2 saat için 62 °C'de sallayarak inküter örnekleri.
   16. 2 saat sonra, ısı örnekleri 95 °C için 10 dakika bir termocycler kullanarak.
   17. Örnekleri oda sıcaklığına kadar soğutun.
   18. Manyetik ayırıcı kullanarak pelet manyetik boncuklar ve transfer supernatant (ilgi DNA içerir) yeni bir mL tüp.
   19. Standart bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın.
   20. Saflaştırılmış DNA °C'de saklanabilir ve standart qPCR protokollerinde şablon olarak kullanılabilir. QPCR çalıştırmak için üretici protokollerini izleyin.
6. ChIP-qPCR veri analizi
   NOT: ChIP-qPCR sonuçlarını analiz etmek için iki yaygın yöntem IgG antikor ve% 1 Giriş yöntemi üzerinde kat zenginleştirme vardır. Her iki analiz yöntemleri için mükemmel bir şablon hızlı bir şekilde her IP antikor / faiz hedef³⁷için kat zenginleştirme hesaplamak için ticari bir kaynak tarafından sağlanmaktadır.
   1. Kat zenginleştirme ve % Girişi hesaplamak için, analiz şablonundaki ilgili bölgeye her bir antikor (spesifik olmayan IgG, IP H3K27ac antikor ve %1 Giriş) için elde edilen qPCR verilerinden ΔCt değerlerini kopyalayıp yapıştırın ve Kat Zenginleştirme ve Verim % Girdiotomatik olarak doldurulacaktır.

In vitro histon asetiltransferaz (HAT) tsuraj ı, p HAT aktivitesini histon substrata doğru inhibe eden bileşikleriçin prob için kullanılabilir. Şekil 1A, HAT tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Anakardik asit, bilinen BIR HATi^3,38, μM arasında bir konsantrasyon aralığında bu titretinde kullanılmıştır. μM'de, anakardik asit histon 3, Lizinler 9 ve 18'de histon asetilasyonunu katalize eder (Şekil 1B, şerit 5 şerit 1' e karşı). Düşük ilaç dozları büyük ölçüde p HAT aktivitesini inhibe olmayabilir çünkü bir konsantrasyon aralığı bu teşriyi kullanılmıştır(Şekil 1B, lanes karşı şerit 1). Lane 6'da reaksiyona asetil-CoA eklenmedi ve p kataliz ve rekombinant H'de histon asetilasyonunun bazal düzeyleri için negatif kontrol görevi görüyor (Şekil 1B). p ve H protein düzeyleri yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır (Şekil 1B). Bu immünoblot sonuçları ImageJ³⁹(Şekil 1C)kullanılarak ölçüldü. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğu ile her asetilasyon probu için DMSO kontrolünün bant yoğunluğu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. μM'de anakardik asit için nicelik, DMSO kontrolüne karşı H3K18ac ve H3K9ac'ta güçlü bir azalma gösterir ve Şekil 1B'dekigörsel sonuçları doğrular.

Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) kontrolünde HDACi, bir HATi²⁴ile eş kuluçkadan önce kromatindeki histones'u hiperasetiletmek için bir araç olarak kullanılır , örneğin p inhibitörü A^2,4. Bu tetkikin amacı HDACi tarafından indüklenen histon hiperasetilasyonu zayıflatmak için HATi etkinliğini belirlemektir. Şekil 2A, ChHAI tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Bu töhlükte, Histon 3'te HDACi MS ile MCF-7 hücrelerinin tedavisi, birkaç lizin kalıntısı üzerinde(Şekil 2B, şerit 4 şerit 1' e karşı). H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri düşüktü, ChHAI tsurel bir HDACi eklemenin faydalarını gösteren(Şekil 2B, şeritler ). MS ile A eklenmesi H3K18 ve H3K27 artan histon asetilasyon zayıflatır, ancak H3K9(Şekil 2B, şeritler ) zayıflatır. Daha da önemlisi, H3K9ac hücre kültürü²p tarafından düzenlenir değildir , Bu deneyde A özgüllüğünü gösteren. Bu immünoblot sonuçları Şekil 2C'deölçüldü. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğuile her asetilasyon probu için tek başına MS 'in (Lane 4) bant yoğunluğuile karşılaştırılarak hesaplandı. H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri tespit edilmediği için şerit sayısallaştırılmadı.

Kromatin İmmünopan-kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR), genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. Onkogen ekspresyonunu kontrol eden gen düzenleyici elemanlarda HATi'nin etkilerini araştırmak için kullanılabilir²⁵. Şekil 3A, ChIP-qPCR protokolü için deneysel bir şema sağlar. 24 saat boyunca 3 μM A ile tedavi edilen MCF-7 hücreleri H3K27ac'ta zenginleştirilmiş histon-DNA komplekslerinin immünopresidibatasyon yoluyla ChIP-qPCR'ye tabi tutuldu (Şekil 3). Saflaştırılmış DNA Cyclin D1 promotör dizisi için analiz edildi. ChIP-qPCR astarlar genomdaki belirli bir DNA dizisine karşı tasarlanmıştır ve çökelmiş DNA'nın göreceli miktarını tespit etmek için kullanılır. Çökelmiş DNA miktarı, araştırılan genomik bölgede ilgi proteininin bolluğunu yansıtır. Nitekim, DMSO örneğinde, IgG kontrol antikortarafından çökeltilen DNA, Siklin D1 promotörü için qPCR reaksiyonundaki H3K27ac antikordan daha yüksek bir Ct değeri üretir (Şekil 3B). Bu non-spesifik IgG kontrolü Siklin D1 organizatörü h3K27ac spesifik antikor daha az DNA-protein kompleksleri çöktürülmüş olduğunu gösterir. Bu non-spesifik IgG kontrolü(Şekil 3B)üzerinde H3K27ac ,73 kat zenginleştirme anlamına gelir.

Bu kat zenginleştirme, H3K27ac spesifik antikor başarıyla immünoppresipitated asetillated histones ve H3K27ac Cyclin D1 organizatörü zenginleştirilmiş olduğunu kanıt sağlar. H3K27ac antikor kalitesini nitedikten sonra DMSO ve A tedavi edilen gruplar arasında karşılaştırma yapılabilir. Şekil 3C'degösterildiği gibi, A % Giriş yöntemi (n=2 temsili sonucu) kullanarak DMSO kontrolü ne karşı Cyclin D1 organizatörü nde H3K27ac zenginleştirme azaltır. Daha da önemlisi, A önemli ölçüde hücre kültürü²H3K27ac azaltmak için bilinmektedir^,4.

ChIP-qPCR ham %Girdi değerleri, deneysel eğilimin tekrarlanabilir olmasına rağmen bağımsız biyolojik kopyalar arasında son derece değişken olabilir. Bu nedenle, kontrol ve ilaç tedavisi¹⁰arasındaki tekrarlanabilir oranı göstermek için DMSO kontrolünün normalleştirilmiş bir yüzdesi olarak veri sunmak yararlı olabilir. Örneğin, Şekil 3D'deA, Cyclin D1 organizatöründeki H3K27ac doluluk oranını önemli ölçüde düşürebilir (n=2). İstatistiksel analiz, Öğrencinin t-testine (*P < ) dayanmaktadır.

Şekil 1: Anakardik asit, HAT analizinde p enzimatik aktivitesini inhibe eder. (A) HAT suresinin enzimatik reaksiyonu gösteren şematik diyagramı. (B) Anakardik asit p enzimatik aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe etti ve H3K18 ve H3K9'da μM 'de (şerit 5) DMSO kontrol tedavisine karşı histon asetilasını dindüşürdü (şerit 1). Lane 6 reaksiyona Asetil-CoA yoksun ve histon asetilasyon için olumsuz bir kontrol olarak görev yaptı. (C) (B) immünoblot sonuçları sayısallaştırılmıştır. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğu ile her asetilasyon probu için DMSO kontrolünün bant yoğunluğu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: p inhibitörü A ChHAI satografyasında histon hiperasetiliyi güçlü bir şekilde zayıflatır. (A) ChHAI tsurcunun şematik diyagramı. (B) MCF-7 hücrelerinde, HDAC inhibitörü MS H3K18, K27 ve K9'da (şerit 4) DMSO kontrolüne (şerit 1) karşı güçlü bir şekilde histon asetilasyonu nasibini yükseltmiştir. Ms ile bilinen bir p HAT inhibitörü olan A'in eklenmesi H3K18 ve K27'de histon asetilasyondaki artışı zayıflatmış, ancak H3K9'da (şerit şeritli 4) zayıflatmamak. (C) (B) immünoblot sonuçları sayısallaştırılmıştır. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğuile her asetilasyon probu için tek başına MS 'in (Lane 4) bant yoğunluğuile karşılaştırılarak hesaplandı. H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri tespit edilmediği için şerit sayısallaştırılmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: p inhibitörü A, ChIP-qPCR ile ölçülen Siklin D1 promotöründe H3K27ac düzeylerini düşürür. (A) ChIP-qPCR protokolünün şematik diyagramı. (B) IgG ve H3K27ac immünopresiyağışları için Siklin D1 promotörü için temsili qPCR Ct değerleri. IgG kontrolü daha yüksek bir Ct değerine sahipti, bu da H3K27ac antikorun spesifik olmayan IgG antikorüzerinde H3K27ac için başarıyla zenginleştirilmiş olduğunu gösteriyordu. (C) A (3 μM) tedavi 24 h downregulated H3K27ac için Cyclin D1 organizatörü MCF-7 hücrelerinde DMSO kontrol tedavisi ile karşılaştırıldığında (n= 2 temsilcisi sonucu). (D) İki bağımsız ChIP deneyinden elde edilen %Giriş, DMSO kontrolünün bir yüzdesi olarak DMSO kontrolüne normalleştirildi. MCF-7 hücrelerinde A ile tedavi önemli ölçüde cyclin D1 organizatörü h3K27ac doluluk düzenler. İstatistiksel analiz, Öğrencinin t-testine (*P < ) dayanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tamponların ve kullanılan çözümün tarifleri.

Ek dosyalar: Protokoller için ek deneysel şemalar.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Lizin asetiltransferazlar (KATs) histon kuyrukları ve transkripsiyon faktörleri gen transkripsiyon^düzenlemekiçin çeşitli lizin kalıntıları asetit 2^,3. Son yirmi yılda yapılan çalışmalar, CBP/p, PCAF ve GCN5 gibi KAT'ların onkojenik transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girdiği ve çeşitli solid tümör tiplerinde tümör büyümesini artırmaya yardımcı olduğunu ortaya koymuştur^4,5,^9,,15,16,^17,,18. Tümör büyümesini teşvik onların ortaya çıkan rolü nedeniyle, KATs kanser tedavisinde yeni hedefler olarak araştırılmaktadır. Yeni KAT inhibitörleri (KATi) klinikte kullanmak için hareket etmeden önce potens, seçicilik ve güvenlik açısından dikkatli ve titizlikle test edilmelidir. Son kanıtlar, daha önce açıklanan KATi bileşiklerinin hedef etkileri kapalı sergive kötü kimyasal problar²¹olarak bilimsel literatürde kullanılmadan önce kötü karakterize olduğunu göstermiştir. Bu nedenle KATi karakterizasyonu için sıkı yöntemler gereklidir. Burada açıklanan üç protokolleri karakterize ve KATs histone asetiltransferaz (HAT) fonksiyonu hedefleyen yeni inhibitörleri doğrulamak için kullanılabilir: bir in vitro HAT tsay, ChHAI tsay, ve ChIP-qPCR. Bu protokoller CBP/p ve inhibitörlerini örnek olarak kullanır, ancak bu yöntemler diğer KAT'lerin araştırılmasında gelecekteki uygulamalara kolayca uyarlanabilir.

HAT testi basit ve bir test tüpünde HAT işlevini inhibe potens için bileşikleri ekrana uygun maliyetli bir yoldur. Saflaştırılmış HATs (ya rekombinant^4,10 veya immünoppresipitated⁴⁰) bu test test edilebilir, ancak rekombinant CBP / p bu protokolde bir örnek olarak kullanılır. CBP/p, asetil grubundan hedef substrat^3'tekilizin kalıntısına asetil grubu aktaran enzimatik bir HAT etki alanına sahiptir. En karakterize CBP/p histon hedefleri Histone 3 Lizin 18 ve 27 (Sırasıyla H3K18 ve H3K27)^2,3,10,11. HAT tsay'ında saflaştırılmış p HAT etki alanı asetil-coa ve Histon ile bir substrat olarak kuluçkaya yatırılır. Kuluçka döneminde p, H3K18 ve H3K27 dahil olmak üzere birçok H kalıntısında asetilasi katalize edecektir. Bu kalıntılar üzerinde asetilasyon göreceli bolluk immünoblotting ile ölçülebilir. Bu test tüpü reaksiyonu p'e bağlanan ve HAT aktivitesini (HATi) engelleyen yeni bileşikleri taramak için kullanılabilir. Örneğin, anakardik asit, bilinen bir HATi³⁸, güçlü dmso kontrolü ile karşılaştırıldığında hem H3K18 ve H3K9 histon asetilasyon düzenler(Şekil 1B, şerit 5 karşı şerit 1). Deneysel reaksiyonlara Asetil-CoA(Şekil 1B, Lanes ) veya histon asetilasyonun p kataleksi oluşmaz(Şekil 1B, Lane 6) eklemek kritik öneme sahip. Asetil-CoA yokluğu da p kataliz için negatif kontrol olarak kullanılabilir ve rekombinant H histon asetilasyon bazal düzeyleri için.

HAT tonu yaparken, her reaksiyonun aynı miktarda p, H ve Asetil-CoA aldığından emin olmak önemlidir. İmmünoblottaki H ve p seviyeleri jel için yükleme kontrolleri olarak hizmet vermektedir. Bu teşp için, yere özgü histon asetil antikorları veya pan-asetil antikor immünoblot için kullanılabilir. İmmünoblot kalitesini iyileştirmek için optimize ederken, immünolotlama için doğrulanmış antikorlar kullanmak ve başlangıçta antikor seyreltme için üreticinin tavsiyelerini takip etmek çok önemlidir. Protokol bölümünde kullanılan antikor seyreltmeleri referans amaçlıdır ve seyreltmeler ilk deneylerin sonuçlarına göre değiştirilebilir (örneğin, sinyal çok güçlüyse antikor daha da seyreltilebilir). Sadeliği nedeniyle, HAT tsay yeni inhibitörleri tarama için mükemmel bir başlangıç deneyidir. Ancak, HAT tsay dezavantajları vardır. HAT testi ile ilgili önemli bir endişe, bir test tüpünde etkili bileşiklerin yaşayan bir sistemde etkisiz kanıtlayabileceğidir. Hücre kültüründe bileşik etkinliği hücresel geçirgenlik sorunları, hücresel metabolizma ve bileşik stabilite ile değiştirilebilir, çünkü bu bir sorundur. Buna ek olarak, KATs, özellikle CBP / p, hücre^,kültürü^3,41^,42kendi KAT aktivitesini düzenleyen birçok protein-protein etkileşimleri var.⁴² Bu nedenle, hücre kültürü deneyleri^20,23HAT analizinde tanımlanan inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır.

Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) analizi boru hattındaki ikinci protokoldür ve hücre kültüründe yeni inhibitörlerin etkilerini doğrulamak için yararlıdır. Bu sataş hdac inhibitörleri kullanır (HDACi)²⁴ hücrelerde histon hiperasetiltion indüklemek için bazal asetilasyon bir immünoblot üzerinde tespit etmek için çok düşük olabilir çünkü. Tercih edilen hücre hatları bir HATi eklenmesinden önce asetitli kromatin birikimi için izin vermek için bir HDACi ile önceden inkübe edilir. HDACi ve HATi'nin birlikte inkübünden sonra hücreler lysed ve belirli histon asetilasyon bölgeleri için standart immünoblotlama prosedürlerine tabi tutulur. Bu çalışmanın amacı HDACi tarafından indüklenen histon hiperasetilasyonu zayıflatmak için yeni HATi etkinliğini belirlemektir. HDACi'ye maruz kalan hücreler, DMSO çözücüse maruz kalan hücrelerden anlamlı olarak histon asetilasi düzeylerine sahip olmalıdır(Şekil 2B, şerit 4 karşı şerit 1). HDACi ile birlikte HATi eklenmesi tek başına HDACi tedavisiile karşılaştırıldığında immünoblot sinyalini azaltmak için bekleniyor(Şekil 2B, lanes karşı şerit 4). Histon asetilasının bazal düzeyleri(Şekil 2B, Lanes ) saptanması zordur ve bu protokole HDACi eklemenin önemini vurgular. MS (Entinostat) örnek olarak kullanılır ancak diğer HDACi^24,43kullanılabilir. MS sınıf I HDACs karşı değişken inhibitör konsantrasyonları rapor ve genellikle düşük mikromolar konsantrasyonları nanomolar ile HDAC1 ve HDAC3 inhibe, sırasıyla^43,44. Ms konsantrasyonları geniş bir yelpazede literatürde kullanılır^45,46,47, ama 3 μM tedavi MCF-7 hücrelerinde histon asetilasyon sağlam ve tekrarlanabilir bir artış sağlar. Bu nedenle, farklı bir hücre hattı kullanırken ChHAI testi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için hdaci ve HATi konsantrasyonları geniş bir yelpazede bir başlangıç ekranı gerçekleştirmek için yararlı olabilir.

HAT tahsinine benzer şekilde, immünoblot protokolünün uygun antikorlar, optimum antikor seyreltmeleri ve dikkatle kontrol edilen numune yüklemesi yoluyla kaliteli sonuçlar elde etmek için optimize edilmesi gerekebilir. Dikkatle kontrol edilen numune yüklemesi bu protokolün başarısı için gereklidir ve tüm numunelerin protein içeriğini dengelerek ve eşit hacimli numuneleri immünoblot jelinin kuyularına borulama yoluyla elde edilebilir. Bir pan-asetil antikor bu protokolde sondalama için kullanılabilir. Ancak, KATs bazı histon lizin kalıntıları için özgüllük var ve HATi hücre kültürü¹tüm histon asetilasyon siteleri etkilemez çünkü siteye özgü asetil antikorları ile takviye edilmelidir^,2,^4,,5,10,11. HAT ve ChHAI tahlillerinde histon asetilasyonunu azaltmada etkili olan inhibitörler ileri değerlendirme için güçlü adaylardır. Daha da önemlisi, HAT ve ChHAI tahlilleri sadece histon asetilasyonküresel değişiklikler hakkında veri sağlayan sınırlama var. Bu sınırlama genomun belirli bölgelerinde yeni HATi etkilerini karakterize etmek için ihtiyaç yaratır.

Kromatin İmmünopan-kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) boru hattının son protokolüdür ve genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini değerlendirir. Bu testte H3K27ac'ta zenginleştirilmiş genomik bölgeler immünoprebat (IP) ile saflaştırılır ve qPCR'de DNA astarları kullanılarak analiz edilir. Bu teknik, HATi'nin gen destekleyicileri ve arttırıcılarda histon modifikasyonlarını nasıl etkilediğine dair mekanik bir içgörü sağlar. ChIP-qPCR sağlam bir tekniktir ve tüm genom diziliminden (örneğin, ChIP-seq) daha az maliyetlidir, ancak sonucu etkileyen birçok adım nedeniyle optimize etmek zor olabilir. Doğru optimize etmek için en zor adım adım , immünopresipitasyon. Bu adımı optimize etmek zordur, çünkü eğer 'deki saflaştırılmış DNA son derece seyreltilmişse qPCR reaksiyonunda kötü sonuçlara neden olabilir (örn. hedef gen dizisinin amplifikasyonu ve çok yüksek ΔCt değerleri). IP adımının başarısı, protein hedefinin bolluğu ve IP antikorunun kalitesi gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. IP adımının başarısını doğrulamak için IP H3K27ac antikorunun ip ikontrolünden karşı kalitesini doğrulamak çok önemlidir. Örneğin, Şekil 3B'de,H3K27ac spesifik antikor, spesifik olmayan IgG kontrolü üzerinde ,73 kat zenginleştirme görüntüler. Bu H3K27ac antikor yüksek kaliteli olduğunu ve H3K27ac Cyclin D1 organizatörü zenginleştirilmiş olduğunu gösterir. IP antikordoğrulaması yapıldıktan sonra, DMSO ve A tedavi edilen gruplar arasında karşılaştırma yapılabilir. Şekil 3C'degösterildiği gibi, A % Giriş yöntemi (n=2 temsili sonucu) kullanarak DMSO kontrolü ne karşı Cyclin D1 organizatörü nde H3K27ac zenginleştirme azaltır. IP antikordüşük kaliteli olduğunu kanıtlıyorsa ve ilk deneylerde kat zenginleştirme göstermiyorsa, adım 'deki hücre sayılarını artırmayı deneyin. Daha yüksek hücre sayıları, lysat'ın toplam protein içeriğini artırarak zayıf antikor kalitesini telafi etmeye yardımcı olabilir ve IP reaksiyonuna daha fazla protein eklenmesini sağlar.