rb proteini / Retinoblastom Yatkınlık Geni Ve Retinoblastom | Makale | Türkiye Klinikleri

Rb Proteini

rb proteini


Yazdır

İnsan Papillomavirusunun Genomik Yapısı ve Proteinleri

Genomic Organization and Proteins of Human Papillomavirus

Gülçin ALP AVCI

Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara - Hitit Üniversitesi Sağlık Yüksekokulu,
Mikrobiyoloji Bölümü, Çorum.

Gazi University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara - Hitit University School of Health, Department of Microbiology, Corum, Turkey.

ÖZET

İnsan papillomavirus (HPV) enfeksiyonları, dünyada cinsel yolla bulaşan hastalıkların en önemlilerinden biridir. Bugün için, DNA dizisi kullanılarak tanımlanan 200'den fazla HPV tipi bulunmaktadır. HPV tipleri onkojenik potansiyellerine göre; yüksek riskli (tip 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 vb.), olası yüksek riskli (tip 26, 53, 66) ve düşük riskli (tip 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54 vb.) tipler olarak gruplandırılmaktadır. Yüksek riskli HPV tipleri, günümüzde servikal intraepitelyal neoplazi ve serviks kanserinin temel etiyolojik faktörü olarak kabul edilmektedir. Papillomaviridae ailesinde yer alan HPV tipleri, çıplak, ikozahedral simetrili, yaklaşık 55 nm çapında viruslardır. Çift iplikli çembersel DNA'dan oluşan 8 kb büyüklüğündeki genom; virusun replikasyonunda ve hücre transformasyonunda rol oynayan erken proteinler (E1, E2, E4, E5, E6, E7) ile kapsid yapısını oluşturan geç proteinleri (L1, L2) kodlar. HPV DNA'sının konak hücre kromozomuna integrasyonu, virusun kalıcılığı ve karsinojenik etkileri için önem taşımaktadır. İntegrasyon genom boyunca rastgele meydana gelebilir ve bu durum virusun onkoproteinleri olan E6/E7 gen ürünlerinin ekspresyonunda artışa, dolayısıyla da onkogeneze yol açabilir. Ancak integrasyon olmadan da E6/E7 ekspresyon artışı gerçekleşebilmektedir. Servikal kanser hücrelerinin çoğunda HPV integrasyonu genellikle E2 gen bölgesinde kırılmaya neden olmakta ve bu durum E6 ve E7 onkogenlerinin ekspresyonunda artışa yol açmaktadır. Özellikle HPV-16 ve HPV-18 gibi yüksek riskli tiplerin E6 ve E7 proteinleri, sırasıyla p53 ve retinoblastoma proteini (pRb) gibi tümör baskılayıcı proteinler ile etkileşip onların fonksiyonlarını inhibe etmekte; böylece hücre çoğalmasının kontrolünü bozmakta ve hücrelerin ölümsüzleşmesine neden olmaktadır. E6 proteininin p53'e bağlanması hücrenin G1 fazında tutulmasına, apoptoz ve DNA tamirinin durdurulmasına yol açar. E7 proteini ise, pRb ve siklin-E gibi mitotik interaktif hücresel proteinler ile ilişkiye girerek, hücresel DNA sentezi ve hücre çoğalmasının uyarılmasında rol oynar. Son yıllarda tanımlanan ve sadece bazı papillomavirus tiplerinde (HPV 1, 11, 16, 31, 33) bulunan E3 ve E8 genleri de erken gen bölgesinde yer almaktadır. Bir füzyon proteini olan E8^E2C'nin, HPV DNA replikasyonunun negatif bir regülatörü olduğu ve viral kopya sayısını kontrol ederek HPV epizomlarının stabilitesini sağladığı düşünülmektedir. Bu derleme yazıda HPV'nin genom yapısı ve gen ürünlerinin fonksiyonları özetlenmektedir.

Anahtar sözcükler: İnsan papillomavirusu; genom yapısı; viral protein; E2; E6; E7.

ABSTRACT

Human papillomavirus (HPV) infections are one of the most common sexually-transmitted diseases worldwide. Nowadays, more than 200 HPV types have been identified by DNA sequencing. HPV types are also grouped into three, such as high-risk (types 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, etc), probable high-risk (types 26, 53, 66) and low-risk (types 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, etc) types according to their oncogenic potential. HPV is currently considered as the main aetiological factor of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. HPV types classified in Papillomaviridae family, are non-enveloped, icosahedral symmetric viruses about 55 nm in size. Viral genome consists of circular double-stranded DNA, about 8 kb in size, encodes for early proteins (E1, E2, E4, E5, E6, E7) which play role in virus replication and cell transformation, and for late (L1, L2) proteins which are the structural units of the viral capsid. Integration of HPV DNA into the host chromosome is crucial for viral persistence and for carcinogenic effects. Viral DNA may integrate randomly to the cell genome and integration can lead to the deregulation and increase of E6/E7 expression leading to oncogenesis. However, increased expression of E6/E7 gene products may occur without genome integration. E6 and E7 proteins of especially high-risk HPV types (e.g. types 16 and 18) interact with tumor supressor proteins such as p53 and retinoblastoma (pRb) proteins, respectively; inhibit their functions and cause uncontrolled proliferation and immortalization of the cells. The binding of E6 protein to p53 leads its rapid degradation, and the eclipse in the G1 phase, DNA repair mechanisms and apoptosis are terminated. In the other way, E7 protein interacts with pRb and mitotically interactive cellular proteins such as cyclin-E, causing stimulation of cellular DNA synthesis and cell proliferation. Recently identified genes E3 and E8 are located in early gene region and found only in a few papillomavirus types (HPV 1, 11, 16, 31, 33). A fusion protein, E8^E2C, functions as a negative regulator for HPV DNA replication and it is thought that this protein may play a role in the control of viral copy number as well as in the stable maintenance of HPV episomes. In this review article, the genomic structure of HPV and the functions of gene products have been summarized.

Key words: Human papillomavirus; genomic organization; viral protein; E2; E6; E7.

Geliş Tarihi (Received): 14.12.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.04.2012

GİRİŞ

Papillomavirusların onkojenik potansiyeli ile ilgili uzun yıllar süren araştırma ve tartışmaların sonunda, insan papillomavirusları ile servikal kanser arasındaki ilişkinin 1976 yılında Harald zur Hausen tarafından gösterilmesi, bu virusların virolojik ve klinik önemini daha da artırmıştır1. Bugün için insan papillomaviruslarının yüksek riskli tipleri, tüm dünyada serviks kanserinin primer etiyolojik ajanı olarak kabul edilmekte; özellikle tip 16 ve 18 servikal kanserlerin %70'inden sorumlu tutulmaktadır2,3.

İnsan papillomavirusları (Human papillomavirus; HPV), Papillomaviridae ailesinde sınıflandırılan, çıplak, ikozahedral simetrili, yaklaşık 55 nm çapında, çift iplikli DNA içeren viruslardır. Viral kapsid 60 hekzon ve 12 penton olmak üzere toplam 72 kapsomerden oluşur; protein kılıf, bir majör ve bir minör olmak üzere iki kapsid proteini içerir4. Bu viruslar DNA yapılarına göre sınıflandırıldığından serotipler yerine genotipler olarak ve keşfedildikleri sıraya göre numaralandırılır4,5. HPV'lerin sınıflandırılması, tür orijini ve DNA hibridizasyonuyla tespit edilen viral genomlar arasındaki homolojinin derecesine bağlıdır. Günümüzde 200'den fazla HPV tipi tanımlanmıştır. HPV tipleri ayrıca, klinik olarak karsinojenik potansiyellerine göre de; (1) düşük riskli HPV tipleri (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 ve CP6108), (2) olası yüksek riskli HPV tipleri (26, 53 ve 66) ve (3) yüksek riskli HPV tipleri (16 başta olmak üzere 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68, 73 ve 82) olmak üzere üç gruba ayrılmışlardır4,6.

İnsan papillomavirusları dünyada yaygın olarak bulunmakta ve bulaşma direkt temas ya da cinsel yolla olmaktadır7,8. Virus insanda primer olarak skuamöz epitel hücreleri ve mukozayı enfekte etmekte; deri ve mukozalarda bazal tabakalardan başlayarak çeşitli lezyonlar oluşturmaktadır. Düşük riskli HPV tipleri (özellikle HPV-6 ve HPV-11) genital siğiller ve rekürrent larengeal papillomatoz gibi benign lezyonlara neden olurken, yüksek riskli HPV tipleri servikal, vajinal, vulvar, anal, penil ve orofarengeal karsinomayı da içine alan çeşitli kanserlerin gelişiminde doğrudan ya da dolaylı olarak rol oynayabilmektedir2,6,7,8,9. HPV enfeksiyonlarının sonucu, konak faktörlerine bağlı olduğu gibi virusun tipine ve enfekte olan bölgeye de bağlıdır.

HPV GENOMİK YAPISI

Papillomaviruslar, küçük boyutlarına rağmen moleküler biyolojileri oldukça kompleks olan viruslardır. Çift iplikli çembersel DNA'dan oluşan genom yaklaşık 8 kilobaz büyüklüğündedir ve viral proteinleri kodlayan diziler tek bir DNA sarmalı üzerindedir5. Fonksiyonel olarak erken bölge (early; E), geç bölge (late; L) ve uzun kontrol bölgesi (long control region; LCR) olmak üzere üç bölgeye ayrılır. Tüm papillomaviruslarda bu üç bölge, erken pA ve geç pA olarak iki poliadenilasyon (pA) bölgesi tarafından ayrılmaktadır. Erken bölgede sekiz, geç bölgede ise iki açık okuma çerçevesi (Open reading frame; ORF) bulunur. Bütün HPV ORF'ları virusun sadece bir sarmalı üzerinde yer alır ve 10 ORF viral replikasyon döngüsündeki gen ekspresyon sırasına göre erken ve geç olarak isimlendirilir. Erken proteinler (E1, E2, E4, E5, E6 ve E7) viral replikasyon ve hücre transformasyonunda rol oynar5,10. Son yıllarda keşfedilen E3 ve E8'de aynı bölgede bulunmakta olup, E8'in E2 bölgesinin delesyonu sırasında ortaya çıktığı düşünülmektedir11. Geç gen bölgesinde ise L1 (majör kapsid proteini) ve L2 (minör kapsid proteini) proteinleri kodlanmaktadır (Şekil 1)12. Tüm bu proteinler, transmembranın uyarılması, hücre döngüsünün düzenlenmesi ve transformasyon aktivitesinin denetlenmesi gibi pleotropik fonksiyonlara sahiptir12.


HPV PROTEİNLERİ

E1 ve E2 Proteinleri

E1 ve E2 genleri HPV'nin önemli düzenleyici proteinlerini kodlamaktadır. Bu genler parabazal keratinositlerde bulunur; viral epizomun dengeye getirilmesinde, viral replikasyonun başlatılmasında ve replikasyonda rol oynar. E2 tarafından kodlanan protein LCR'deki E2 bağlanma yerine bağlanarak transkripsiyonu baskılar. E1 tarafından kodlanan protein ise promoter bölgesine E2'nin bağlanmasını kolaylaştırır13,14. E2 proteini, prodüktif enfeksiyon sırasında çeşitli roller üstlenmektedir. Bu protein, bazal hücrelerde viral DNA replikasyonunun başlaması ve genomun açılması için gereklidir14. Farklılaşmamış hücrelerde E2 proteini, düşük dozlarda transkripsiyonu artırmak için bir viral transkripsiyonel transaktivatör gibi davranırken, yüksek konsantrasyonlarda transkripsiyonel faktörlerin, onları tanıyan dizilere bağlanmasını engelleyerek baskılayıcı hale gelebilir15. Farklılaşmış hücrelerde ise E2 proteini, geç promoter bölgesindeki değişimden dolayı transkripsiyonda baskılayıcı fonksiyonunu kaybeder. Bu durum, E1 ve E2 protein seviyelerinin ve bu sebeple viral DNA amplifikasyonunun hızlı artışıyla sonuçlanır. Servikal kanser hücrelerinin çoğunda, HPV integrasyonu genellikle E2 gen bölgesinde kırılmaya neden olur ve bu kırılma E2 proteininin fonksiyon kaybıyla sonuçlanır15,16. Aynı zamanda elde edilen veriler, E2 gen bölgesinde meydana gelen bu kırılmayla birlikte, P97 promotor aktivitesinde ve E6 ile E7 viral onkogenlerin ekspresyonunda artış olduğunu göstermektedir16. E2 aynı zamanda viral genom replikasyonu için de gereklidir. E2 özgül olarak E1'i tanır ve viral replikasyon orijininde (Ori) E1'i toplar, burada E1-E2 kompleksi oluşur17. Yapılan çalışmalarda ayrıca, E2 aktivasyonunun, HPV ile enfekte hücrelerde apoptozu ve yaşlanmayı uyardığı, buna karşın E6 ve E7 transkripsiyonunu kısmen inhibe ettiği belirlenmiştir10,13,18.

E1 proteini, 68 kDa'luk ATPase, DNA helikaz ve DNA sarmalının açılması için aktiviteye sahip olan nükleer bir proteindir. Düşük kuvvetle viral Ori'ye bağlanır ve bağlanma afinitesi E2 proteini ile artırılabilir. E1, DNA replikasyonunu aktive etmek için DNA polimeraz-a'nın alt üniteleriyle etkileşir. E1 proteini, hem viral DNA replikasyonunun başlamasında hem de replikasyon çatalında helikaz aktivitesine bağlı olarak elongasyonda rol oynamaktadır17.

E4 Proteini

E4 proteini enfeksiyonun geç döneminde bol miktarda üretilir. Tam uzunlukta bir E4 proteini, uç uca eklenmiş E1-E4 transkriptlerinden oluşur. E4 ORF ile E1'in ilk beş aminoasidi 17 kDa'luk E1-E4 füzyon proteinini oluşturur. E1-E4 transkriptleri HPV'nin replikasyon döngüsü süresince salınmaktadır. Tam uzunluktaki E1-E4 proteini, üst farklılaşmış hücre tabakalarında proteolitik olarak parçalanmış polipeptid ürünlerine bağlıdır ve en yüksek düzeyde salınım, farklılaşmış suprabazal tabakada meydana gelir13,15. Virusun hayat döngüsünde E1-E4'ün fonksiyonu hala tam olarak açık değildir. E1-E4 proteini özellikle sitoplazmada yer almaktadır. Yüksek riskli HPV tiplerinin E4 proteini, enfekte hücrelerin sitoplazmasında yaygın olarak dağılır ve keratin aracı (intermediate) filamentleri (IF) ile organize filamentöz bir ağ formu oluşturur. Ayrıca in vitro deneyler, bu proteinin hücrenin iskelet yapısında bozulmalara (sitoskeletal kollaps) yol açarak virusun salınımını kolaylaştırdığını düşündürmektedir17,19.

E5 Proteini

E5 proteini yaklaşık 5 kDa büyüklüğünde, 83 aminoasitlik küçük bir hidrofobik membran proteinidir. Başlıca endoplazmik retikulumda, Golgi cisimciğinde ve plazma membranlarında bulunmaktadır. E5 proteini, enfeksiyonun başlangıcında oldukça önemlidir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), trombosit aktive edici faktör reseptörü (PAFR) ve koloni uyarıcı faktör (CSF)-1 reseptörü ile bir kompleks oluşturarak hücre çoğalmasını uyarır14. Ayrıca E5 proteini, apoptozu izleyen DNA hasarında da rol oynamaktadır. HPV enfeksiyonu ile gelişen servikal kanser lezyonlarında, epizomal viral DNA sıklıkla konak DNA'sına entegre olmakta ve E5 proteinini kodlayan diziyi de içeren genomun azımsanmayacak bir parçası delesyona uğramaktadır. Bu nedenle, HPV ile ilişkili karsinogenezin geç dönemlerinde E5 zorunlu değildir13,14. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, E5 proteininin, virusun çoğalması ve farklılaşmış hücrelerde viral gen ekspresyonunun modülasyonunda E7 ile ortak bir rol oynadığını göstermiştir15.

E6 ve E7 Proteinleri

HPV'lerin onkojenik fonksiyonları, özellikle E6 ve E7 proteinlerinin üretimine bağlıdır; zira E6 ve E7, HPV'nin iki temel onkoproteinidir. Çeşitli çalışmalarda, HPV E6 ve E7 genlerinin tümör süpresör genlerinin fonksiyonlarını baskılamadaki kritik rolü vurgulanmaktadır2,6,13,17. E6 onkoproteini, yaklaşık 17 kDa büyüklüğünde olup, yüksek riskli HPV'lerde konak hücrenin hem nükleus hem de sitoplazmasında bulunur. E6 proteini, p53 ve hücresel ubikütinasyon enzim E6-AP'yi (protein yıkımında kullanılan bir enzim) kapsayan üçlü bir kompleksin oluşumuyla, tümör baskılayıcı p53 proteininin parçalanmasını uyararak hücre proliferasyonunu teşvik eder (Şekil 2). E6 ile aktive edilen parçalanma sonucunda, hücre döngüsünün ilerlemesi bozularak tümör hücre gelişiminde artma gerçekleşir20. Bir tümör baskılayıcı protein olan p53'ün, hücre bölünmesi üzerinde negatif regülatör etkisi vardır. Bu etkiyi, hücre döngüsünün G0 ve G2 fazından S fazına geçişini kontrol ederek gerçekleştirmektedir21. Ayrıca p53, hücre döngüsünü durduran veya apoptozu uyaran bir tümör baskılayıcısıdır. Tüm bu fonksiyonlarıyla p53 hücrede meydana gelen DNA hasarlarını gidermek üzere hücre döngüsünü durdurarak, DNA tamiri için gerekli olan onarımın yapılmasını sağlar veya ciddi kromozomal defektleri olan hücrelerde apoptozu indükler. E6, p53 üzerindeki etkisiyle kromozomal onarım yapılmadan hücrelerin bölünmesine, kromozomal defektli hücrelerin birikmesine ve apoptotik etkinin ortadan kalkmasına katkı sağlamaktadır22.


E6'nın apoptotik etkiyi ortadan kaldırması, telomeraz enzimini indükleyerek de gerçekleşmektedir. Telomeraz, kromozomların telomer ucuna hekzanükleotid tekrarları ekleyen bir enzimdir. Telomeraz aktivitesi genellikle embriyonik hücrelerle sınırlıdır ve normal somatik hücrelerde yoktur. Telomeraz olmadığı zaman hücrelerin defalarca bölünmesi, yaşlanması ve fonksiyonlarını kaybetmesi söz konusudur23. Bu enzim, erozyona uğrayan ve kısalan telomerleri tamir ederek otoregülasyonu inhibe eder. Böylece hücrenin yaşamını uzatır ve bu durum apoptozun ortadan kaldırılmasını sağlar24. Ancak HPV E6 proteini, telomeraz ekspresyonunu indüklemektedir15.

E7 onkoproteini ise, yaklaşık 12 kDa molekül ağırlığındadır ve öncelikle nükleusta bulunur. Yüksek riskli HPV E7 proteinlerinin temel aktivitesi, retinoblastom (Rb) ailesi üyeleriyle ilişkisi sebebiyle hücrelerin farklılaşmasında rol oynamasıdır. Düşük riskli HPV'nin E7 proteinlerinin aynı zamanda Rb'ye düşük kuvvetle bağlandığı da gösterilmiştir19. Rb proteini DNA hasarına bağlı olarak hücre döngüsünü durdurur veya apoptozu indükler24. E7 proteini Rb'ye cep kangalı (domain) adı verilen bir bölgeden bağlanır. Rb'nin cep kangalı dizisi, tümör baskılayıcı fonksiyonu için önemlidir. Rb proteini, hücre döngüsünün G1 fazından S fazına geçişini inhibe eder ve aktivitesi fosforilasyonla düzenlenir. HPV ile enfekte hücrelerde, E7 proteinlerinin hipofosforile Rb proteinlere bağlanması, Rb proteininin inaktivasyonuyla sonuçlanır ve hücre döngüsünün S fazına ilerlemesine izin verir19,20,25. Rb'nin önemli biyokimyasal fonksiyonlarından biri de, E2F transkripsiyon faktörlerine bağlanmak ve replikasyonda görevli olan enzim genlerinin aktivasyonunu baskılamaktır. Replikasyonda görevli enzim genlerinin baskılanma yeteneği, Rb'nin tümör baskılayıcı fonksiyonuyla ilişkilidir22,25,26. E7'nin Rb proteini (pRb) ve cep protein ailesinin diğer üyeleriyle etkileşimi, büyüme faktörlerinin varlığından bağımsız olarak, pRb ve transkripsiyon faktörlerinin E2F ailesi arasındaki ilişkiyi bozmaktadır. E7 aynı zamanda histon deasetilazları, AP1 transkripsiyon kompleksini ve siklin-bağımlı kinaz (SBK) inhibitörleri p21 ve p27 bileşenlerini içeren hücre proliferasyonuyla ilgili diğer proteinlerle de etkileşmektedir25. Doğal enfeksiyon sırasında ise, p21 ve p27 SBK inhibitörlerinin düzeylerine bağlı olarak bazı hücreler inhibe olur; buna karşın E7 hücre çoğalmasının sürekliliğini sağlar14.

Kanserin gelişiminde E2 bölgesinde sıklıkla kırılma meydana geldiğinden HPV DNA integrasyonu önemlidir (Şekil 3)20. İntegrasyon esnasında E2'de meydana gelen kırılma, E2'nin E6 ve E7 üzerindeki inhibitör etkisini ortadan kaldırır ve E8 bölgesinin oluşumuna yol açar. Sonuçta, E6 ve E7 viral proteinlerinin kontrolsüz olarak eksprese edildiği görülür19,20. Bu nedenle, E6 ve E7 onkoproteinleri kanser gelişimi için önemlidir.


E8 Proteini

E8 proteininin açık okuma bölgesi, sığır papillomavirus tip 1 (BPV-1) ve HPV tip 31 (HPV-31) dışında, birçok tavşan papillomaviruslarında bir onkogen olarak tespit edilmiştir. Ayrıca E8^E2 füzyon proteini, BPV-1 ve HPV-31'de viral transkripsiyon ve replikasyonun negatif bir düzenleyicisi olarak belirlenmiştir26,27. E8 geninin bir parçası olan E8^E2 füzyon proteini, E2 geninin C terminaline bağlanmış olup, viral transkripsiyonun alternatif bir yolunu oluşturmaktadır. E8^E2C'nin, viral yaşam döngüsünün erken evresi boyunca HPV DNA replikasyonunu sınırlandırdığı ve viral kopya sayısını kontrol ederek HPV epizomlarının stabilitesini sağladığı düşünülmektedir27. Yapılan bir çalışmada, E8^E2C eksprese edemeyen HPV-31 mutantlarının, yüksek düzey DNA replikasyonuna rağmen insan keratinositlerinde ekstrakromozomal olarak kalamadığı gösterilmiştir28.

L1 ve L2 Proteinleri

Viral DNA'nın geç bölgesi yaklaşık 3 kb uzunluğunda olup, sırasıyla majör ve minör proteinleri kodlayan L1 ve L2 genlerini içermektedir. L1 proteini yaklaşık 55 kDa, L2 proteini ise yaklaşık 74 kDa büyüklüğünde olan kapsid proteinleridir. L1 proteini, hücreye giriş için a6b4 integrin, heparan sülfat ve glikozaminoglikan dahil üç farklı yüzey reseptörüne bağlanır. L2'nin hücresel yüzey proteinine bağlanması da, HPV enfeksiyonu için gereklidir19. Enfekte hücrenin sitoplazmasında L2 proteini sitoplazmadan nükleusa virusun etkili transportu için beta-aktin ile etkileşir. L1 ve L2 proteinlerinin reseptör aracılı bir yolla nükleus içine taşınması önemlidir. L2 proteininin DNA'ya bağlanmasından ve enkapsidasyon olaylarından sorumlu olduğu ileri sürülmektedir29. Son zamanlarda HPV-16 L2 proteini varlığının, E2'nin transkripsiyonel transaktivasyonunu inhibe ettiği, ancak DNA replikasyonunu etkilemediği bildirilmiştir30. Viral hayat döngüsünün düzenlenmesinde L2-E2 birleşmesinin etkisi hala araştırılmaktadır13,15,17.

KAYNAKLAR

  1. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers-a brief historical account. Virology 2009; 384(2): 260-5. [Özet]
  2. Münger K, Baldwin A, Edwards KM, Hayakawa H, Nguyen CL, Owens M. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J Virol 2004; 78(21): 11451-60. [Tam Metin] [PDF]
  3. Lowy DR, Schiller JT. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prev Res (Phila) 2012; 5(1): 18-23.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  4. De Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. J Virol 2004; 324(1): 17-27. [Özet]
  5. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2002; 2(5): 342-50. [Özet]
  6. No JH, Kim MK, Jeon YT, Kim YB, Song YS. Human papillomavirus vaccine: widening the scope for cancer prevention. Mol Carcinog 2011; 50(4): 244-53. [Özet]
  7. Yarkın F, Vardar MA. HPV immunolojisi ve natürel enfeksiyonlar. Türkiye Klinikleri J Gynecol Obst Special Topics 2009; 2(1): 43-7. [Özet]
  8. Srivastava S, Gupta S, Roy JG. High prevalence of oncogenic HPV-16 in cervical smears of asymptomatic women of eastern Uttar Pradesh, India: a population-based study. J Biosci 2012; 37(1): 63-72. [Özet] [PDF]
  9. Onan MA, Taskiran C, Bozdayi G, et al. Assessment of human papilloma viral load of archival cervical intraepithelial neoplasia by real-time polymerase chain reaction in a Turkish population. Eur J Gynaecol Oncol 2005; 26(6): 632-5.
    [Özet]
  10. Leto MG, Santos Júnior GF, Porro AM, Tomimori J. Human papillomavirus infection: etiopathogenesis, molecular biology and clinical manifestations. An Bras Dermatol 2011; 86(2): 306-17. [Özet]
  11. Motoyama S, Cecilia A. Ladines-Llave, Villanueva SL, Maruo T. The role of human papillomavirus in the molecular biology of cervical carcinogenesis. Kobe J Med Sci 2004; 50(1): 9-19. [Özet] [PDF]
  12. Howley PM. The molecular biology of papillomavirus transformation. Am J Pathol 1983; 113(3): 414-21. [PDF]
  13. Hebner CM, Laimins LA. Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Rev Med Virol 2006; 16(2): 83-97. [Özet]
  14. Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clin Sci (Lond) 2006; 110(5): 525-41. [Özet] [Tam Metin]
  15. Longworth MS, Laimins LA. Pathogenesis of human papillomavirus in differentiating epithelia. Microbiol Mol Biol Rev 2004; 68(2): 362-72. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  16. Tsakogiannis D, Ruether IG, Kyriakopoulou Z, et al. Sequence variation analysis of the E2 gene of human papilloma virus type 16 in cervical lesions from women in Greece. Arch Virol 2012; DOI 10.1007/s00705-012-1236-8. [Özet]
  17. Thomison J 3rd, Thomas LK, Shroyer KR. Human papillomavirus: molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma. Hum Pathol 2008; 39(2): 154-66. [Özet]
  18. Kadaja M, Isok-Paas H, Laos T, Ustav E, Ustav M. Mechanism of genomic instability in cells infected with the high-risk human papillomaviruses. PLoS Pathog 2009; 5(4): e1000397. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  19. Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev 2003; 16(1): 1-17.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  20. Fehrmann F, Laimins LA. Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation. Oncogene 2003; 22(33): 5201-7. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  21. Yim EK, Park JS. The role of HPV E6 and E7 oncoproteins in HPV-associated cervical carcinogenesis. Cancer Res Treat 2005; 37(6): 319-24. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  22. Hubbert NL, Sedman SA, Schiller JT. Human papillomavirus type 16 E6 increases the degradation rate of p53 in human keratinocytes. J Virol 1992; 66(10): 6237-41. [Özet] [PDF]
  23. Köse F, Turan T. Servikal kanser tümörogenezi ve HPV. Türkiye Klinikleri J Gynecol Obst Special Topics 2009; 2(1): 13-8. [Özet]
  24. Kiyono T, Foster SA, Koop JI, et al. Both Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature 1998; 396(6706): 84-8. [Özet]
  25. Ganguly N, Parihar SP. Human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins as risk factors for tumorigenesis. J Biosci 2009; 34(1): 113-23. [Özet] [PDF]
  26. Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med 2003; 348(6): 518-27. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  27. Fertey J, Ammermann I, Winkler M, Stöger R, Iftner T, Stubenrauch F. Interaction of the papillomavirus E8--E2C protein with the cellular CHD6 protein contributes to transcriptional repression. J Virol 2010; 84(18): 9505-15.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  28. Stubenrauch F, Hummel M, Iftner T, Laimins LA. The E8E2C protein, a negative regulator of viral transcription and replication, is required for extrachromosomal maintenance of human papillomavirus type 31 in keratinocytes. J Virol 2000; 74(3): 1178-86. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  29. Finnen RL, Erickson KD, Chen XS, Garcea RL. Interactions between papillomavirus L1 and L2 capsid proteins. J Virol 2003; 77(8): 4818-26. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  30. Pereira R, Hitzeroth II, Rybicki EP. Insights into the role and function of L2, the minor capsid protein of papillomaviruses. Arch Virol 2009; 154(2): 187-97. [Özet]

İletişim (Correspondence):

Öğr. Gör. Dr. Gülçin Alp Avcı,

Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Beşevler, Ankara, Türkiye.

Tel (Phone): +90 312 202 4628

Hitit Üniversitesi Sağlık Yüksekokulu,

Mikrobiyoloji Bölümü,

19030, Çorum, Türkiye.

Tel (Phone): +90 364 223 0730-3509,

E-posta (E-mail):[email protected]

Yazdır


Summary

Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Abstract

Translasyonel modifikasyonlar proteinlerin hücre içi sinyal iletimi uygun düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu değişiklikler arasında küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) hedef proteinlerin hücresel süreçler, gen transkripsiyon, DNA tamiri, protein gibi düzenlemek için çeşitli lizin artıkları kovalent bağlı olduğu bir Ubikuitin benzeri proteindir etkileşim ve bozulması, hücre altı taşıma ve sinyal iletimi. Protein SUMOylation tespit için en yaygın yaklaşım ifade ve bırakmak için basit ve uygun mekanik adresleme için bir vitro biyokimyasal reaksiyon bakteri, rekombinant tagged proteinlerin saflaştırılması dayanır sorular. Ancak, SUMOylation vivosürecinin karmaşıklığı nedeniyle, öyle algılamak ve protein SUMOylation hücrelerde endojen koşullar ne zaman altında özellikle çözümlemek için daha zor. Bu kağıt yazarlar tarafından yapılan bir çalışmada endojen Retinoblastom (Rb) protein, hücre döngüsü ilerleme olumsuz düzenlenmesi çok önemlidir bir Tümör baskılayıcı özellikle SUMOylated erken G1 aşamasında saptandı. Bu kağıt algılama ve Rb SUMOylation çözümleme insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı SUMO-değişiklik Rb, aynı zamanda birçok diğer SUMO hedefli protein, insan hücrelerinde phenotypical ve fonksiyonel incelenmesi için uygundur.

Introduction

Ökaryotik hücrelerde hücre döngüsü progresyon doğru kontrolü belirli olaylar gerçekleşecek bir sıralı şekilde1,2sağlar sıkı bir düzenleyici ağ temel alır. Retinoblastom (Rb) protein, ilk klonlanmış Tümör baskılayıcı1,3bu ağda önemli oyuncularından biri. Rb protein S faz geçiş ve tümör büyüme4,5G0/G1 için özellikle hücre döngüsü progresyon negatif bir regülatör olduğu düşünülmektedir. Ya doğrudan Rb işlev başarısız olur, çocuklarda en sık görülen göz içi malignite için Retinoblastom, ya da kanser5diğer birçok türde katkı sağlıyor. Ayrıca, Rb hücre farklılaşması, Kromatin remodeling ve mitokondri-aracılı apoptosis3,6,7de dahil olmak üzere birçok hücresel yollar ilgilenmektedir.

Translasyonel modifikasyonlar RB işlevi8,9yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon böyle bir değişiklik olduğunu ve genellikle Rb inactivation için yol açar. Durgun G0 hücrelerde, Rb düşük fosforilasyon düzeyiyle etkindir. İlerleme G0/G1 evresi boyunca hücreleri Rb sırayla hiper-fosforile siklin bağımlı protein kinaz (CDKs) ve Rb devre dışı bırakın ve hücre döngüsü bastırmak yeteneğini ortadan siklinlere, siklin E/CDK2 ve siklin D/CDK4/6 gibi bir dizi olduğu gen ifadesi4,10ile ilgili. RB da küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO)11,12,13tarafından değiştirilmiş olabilir.

SUMO hedef proteinlerin çeşitli kovalent bağlı bir Ubikuitin benzeri proteindir. Hücre döngüsü Yönetmeliği de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemlidir, transkripsiyon, protein Hücrede yerleşimi ve bozulması, taşıma ve DNA tamir14,15,16,17,18. SUMO konjugasyon yolu dimerik SUMO E1 aktive enzim SAE1/UBA2, tek E2 conjugating enzim Ubc9, birden çok E3 ligazlar ve SUMO özgü proteaz oluşur. Genel olarak, yeni doğmakta olan SUMO proteinler proteolytically olgun formu oluşturmak için işlenmesi gerekir. Olgun SUMO E1 heterodimerdir tarafından etkinleştirilir ve E2 enzim Ubc9 transfer. Son olarak, SUMO C-terminal glisin kovalent bir substrat hedef lizin Birleşik ve bu işlem genellikle E3 ligazlar tarafından yönetilir. SUMO protein değiştirilmiş substrat belirli proteaz tarafından kaldırılabilir. Bu kağıt yazarlar tarafından bir önceki çalışma Rb SUMOylation hiper-fosforilasyon için erken G1 faz, hücre döngüsü ilerleme13için gerekli olan bir işlem önde gelen CDK2, onun bağlama artırır saptandı. Biz de Rb SUMOylation bir azalma hücre çoğalması kaybolmasına neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, son zamanlarda Rb SUMOylation Rb protein proteasomal işlemlerinden, böylece artan Rb protein hücreleri19düzeyini korur gösterilmiştir. Bu nedenle, SUMOylation çeşitli hücresel süreçler Rb işlevinde önemli bir rol oynar. İleri çalışmalar için işlev sonucu ve Rb SUMOylation, fizyolojik alaka Rb insan hücreleri veya hasta dokuların SUMO durumunu analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirmek için önemli.

SUMOylation tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreçtir. Böylece, genellikle tamamen endojen koşullar altında SUMO modifiye proteinleri tespit etmek zordur. Bu kağıt endojen Rb SUMOylation tespit etmek için bir yöntem sunar. Ayrıca eksojen Rb SUMOylation vahşi tipi Rb ve SUMO-eksik mutasyon11algılamak gösterilmiştir. Özellikle, Jacobs ve ark. özellikle Ubc9 füzyon Yönetmen: SUMOylation (UFDS)20tarafından verilen bir substrat SUMO modifikasyonu artırmak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, bu iletişim kuralını zorla SUMOylation Rb ve fonksiyonel sonuçları analiz açıklar. Verilen bu SUMO yüzeylerde yüzlerce daha önce tarif var ve daha fazla sözde SUMO yüzeylerde birçok proteomik tabanlı deneyleri tespit edilmiştir, bu iletişim kuralı bu proteinler insan hücrelerinde SUMO modifikasyonu analiz etmek için uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. algılama, endojen Rb SUMOylation erken G1 faz

  1. hücre kültür ve hücre döngüsü eşitleme.
    1. Büyüme orta Dulbecco içeren hücrelerde korumak HEK293 ' s % 1 kalem-Strep ve % 10 fetal sığır serum (FBS) 37 ° C ve % 5 CO 2 bir kuluçka adlı ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).
    2. HEK293 hücreleri G0 aşamasında eşitleyin.
      1. Sayısı 15 cm hemasitometre ve tohum ~1.5 x 10 7 hücreleri kullanarak HEK293 hücreleri ile tedavi öncesi 24 h için 25 ml büyüme orta çanağı. Orta ve yıkama % 70 - % 80, aspiratı izdiham ulaştıktan sonra hücreleri iki kez 5 mL ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) prewarmed.
      2. Ekle 25 mL % 1'i içeren DMEM penisilin-streptomisin ve 72 h. yıkamak için hücreleri 3 mL buz gibi PBS kullanarak plaka dışına 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Hücreleri yeni bir 5 mL tüp içine transfer.
      3. Akış Sitometresi (Adım 1.2) tarafından hücre döngüsü analizi için hücreleri küçük bir bölümünü konu; 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de Santrifüjü tarafından kalan çoğunluk hücre toplama ve sonra onları analiz kadar bir ultra-düşük sıcaklık dondurucuda saklayın Rb SUMOylation,.
    3. G1-faz elde etmek için hücreleri G0 eşitleme işleminin sonunda DMEM kaldırın ve geri taze büyüme orta, böylece HEK293 hücreleri hücre döngüsü yeniden girmek izin ekleyin. Daha sonra farklı G1 aşamaları, hücreleri toplamak (erken G1: 30 dk; G1: 2 h) analizi ve daha fazla SUMO hücre döngüsü için tahlil.
    4. HEK293 hücre çift-timidin blok yöntemini kullanarak S aşamasında eşitleyin.
      1. Bir confluency % 50 ve yıkama hücrelere büyümek HEK293 hücre prewarmed PBS ile. Daha sonra büyüme orta ile 2.5 mM timidin 18 h (ilk blok) için takıma ekleyin.
      2. Timidin içeren orta kaldırın ve sonra hücreleri iki kez prewarmed PBS ile yıkayın. Taze büyüme orta hücreleri serbest bırakmak 14 h için eklemek.
      3. Bir pipet ile orta atmak ve hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce büyüme orta 2.5 mM timidin için başka bir 18 h (ikinci blok) ile takıma ekleyin.
    5. G2/M için senkronizasyon, plaka ~1.5 × 10 7 HEK293 hücreleri ile 25 mL büyüme orta 24 h için 15 cm çanak için. 400 ng/mL nihai bir konsantrasyon elde edilir kadar nocodazole Orta olarak ekleyin. Son olarak, hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce 16 h için hücreleri kuluçkaya.
  2. Hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi ile.
    1. Eşitlenmiş HEK293 PBS içinde yeniden askıya alma ve buz gibi % 70 etanol için 2 h 4'te kullanarak hücre süspansiyon düzeltin Bu hücre kümeleme en aza indirmek için hücre süspansiyon dropwise son bir konsantrasyon elde etmek için buz gibi % 100 etanol ekleyin unutmayın ° C. Yavaşça vortexing ise % 70 etanol.
    2. Hücreleri, 500 x g, 5 min için santrifüj kapasitesi sonra dikkatle süpernatant atmak ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı yineleyin.
    3. Ekle 500 µL PBS içeren 50 µg/mL nükleik asit propidium iyodür, %0,1 Triton X-100 ve 1 µg/mL RNase A hücrelere leke ve iyice karıştırın. 15 dk 37 için hücreleri kuluçkaya ° C.
    4. 4 ° C'de örnekleri analiz kadar Akış Sitometresi tarafından depolamak.
  3. Immunoprecipitation endojen Rb protein.
    1. Hazırla HEK293 hücre lysates.
      1. Lyse yavaşça onları buz gibi radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabellek (Tablo 1) 1 ml taze içeren yeniden askıya eşitlenmiş HEK293 hücreleri 20 mM N-Ethylmaleimide, olabilir bir isopeptidase inhibitörü eklendi SUMO proteaz engellemek ve SUMO conjugates stabilize.
      2. Daha fazla buz Dounce Homojenizasyon, sonication veya sadece 10 kat 2 mL şırınga üzerinde bağlı 21 G iğne üzerinden geçerek hücrelerdeyse lunaparkçı. Sonra buz 5 dakika süreyle hücrelerdeyse kuluçkaya
        Not: Rb protein ve diğer arasında kovalent olmayan etkileşim türetilir belirsiz SUMO sinyal ortadan kaldırmak gibi RIPA arabellekte Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Rb-SUMO, daha sonra belirlenmesi için çok önemlidir Non-Rb türler-SUMO.
    2. Hücre lysates 18.000 x g 30 dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Proteinler-80 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.
    3. Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yukarıda açıklanan süpernatant küçük bir bölümünü kurtarmak-e doğru yeni tüp ve-80 mağazasında ° C.
    4. Yukarıdaki supernatants için 1 µg G non-spesifik fare immünglobulin (IgG) aynı tür ve izotip monoklonal Rb antikor ve 20 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. O zaman, nazik rotasyon ile 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
    5. Santrifüj kapasitesi 3000 x g 3 dk de örnekleri 4'te ° C. dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için aktarabilirsiniz. Her örnekleri, 5 µL Rb birincil antikor ve 40 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. Sonra bir gecede nazik rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.
    6. Boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından toplamak ve dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. Boncuk kaybını önlemek için dikkat edin, boncuk kuru Aspire değil.
    7. Boncuk dört kez RIPA arabelleği 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de onlara 4 ° C'de 15 dakika süreyle toplamak döndürme tarafından düşük hızlı Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından boncuk mix ve supernatants atın.
    8. Supernatants son yıkama servisinden kaldırdıktan sonra Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) yükleme arabellek (Tablo 1) x 30 µL 1 boncuk yeniden askıya alma ve iyice karıştırın. 10 dk santrifüj kapasitesi için örnekleri boncuk cips için 1 dakika için 12.000 x g de
      1. Incubate bir sıcakta 100 ° C'de tüpler engelleyin. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için transfer.
    9. Analiz örnekleri tarafından % 4 - % 20 degrade SDS-sayfası jel ve Western blot veya bunları-20 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak.

2. 6XHis öğesini eksojen Rb SUMOylation insan hücrelerinde analizi

  1. hücre kültür ve transfection.
    1. Tohum ~ 6 × 10 6 HEK293 hücreleri 10 cm çanak ve % 75-%85 Konfluent hücreleri elde etmek için normal hücre kültür koşullarda büyüme ortamda 24 h için kuluçkaya. Transfection önce büyüme orta kaldırmak ve prewarmed düşük serum orta 6 mL ekleyin (Tablo malzemeleri görmek) ve bulaşık kuluçka makinesi geri yerleştirin.
    2. İçin Rb bünye SUMOylation tahlil, eklemek 6XHis öğesini Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT ve Ubc9-C93S Plazmidler her 15 µg içinde 500 µL düşük serum 1,5 mL mikro-santrifüj tüpler, ortamda anılan sıraya göre. SUMO-konjugasyon vahşi türü Rb ve onun SUMOylation-arızalı mutant analiz etmek, ya da 6XHis öğesini Rb-WT veya Rb-K720R plazmid GFP-SUMO1 birlikte 10 µg mix
      1. (10 µg) 500 µL serum ortamda 1,5 mL mikro-santrifüj azaltılmış 13 tüpler.
    3. Bu arada, ayrı bir tüp içinde 50 µL transfection reaktif mix (Tablo malzemeleri görmek) 500 µL serum orta azaltılmış ve 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
    4. Tam olarak yukarıda açıklanan iki ayrı tüp birleştirmek ve 15 dk. Ekle transfection oda sıcaklığında reaktif/plazmid kompleksleri hücrelere kuluçkaya ve kültür 8 için devam 37 ° c de % 5 CO 2 s
    5. İle büyüme orta düşük serum orta yerine ve hücreler normal kültür koşullar için 48 saat altında transfection sonra kuluçkaya.
  2. Nikel 6XHis öğesini Rb protein benzeşme yıkmak.
    1. Transfected HEK293 hücreleri parçalayıcı ve toplam protein açıklanan bölüm 1.3.1 ayıklamak.
    2. Santrifüj hücre lysates 18.000 x g de 30 dk 4 ° C. dikkatle supernatants toplamak ve temiz tüpler transfer.
      Not: Protein bu noktada-80, 6 aydan fazla donmuş olabilir ° C.
    3. Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yeni tüp ve-80 mağazasında için yukarıda açıklanan supernatants küçük bir bölümünü kaydedin ° C.
    4. Yıkama 25 µL % 50 nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) özel boncuk RIPA arabelleği iki kez her örnek için bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü ile nikel. 4 3 dk 3000 x g de Santrifüjü tarafından boncuk toplamak ° C.
    5. Ekleyin 1 M imidazole 10 mM son bir konsantrasyon elde etmek için her örnek için. Sonra her örnek hazır Ni-NTA özel boncuk içeren tüp ekleyin.
    6. Boncuk ve nazik rotasyon ile 4 ° C'de 2 h için lysates kuluçkaya. Boncuk 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve pipetting tarafından supernatants dikkatli bir şekilde çıkarın. Boncuk kayıplarını önlemek için boncuk kuru Aspire edin değil.
    7. Boncuk yıkama arabelleği 20 mM imidazole (Tablo 1) içeren 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de rotasyon 15 dk. toplamak için 4 ° C'de tarafından boncuk iplik 4 ° C'de 3 dk 3000 x g de tarafından karıştırın ve supernatants atın.
    8. Son yıkama sonra elüsyon 30 µL arabellek içeren 250 mM imidazole (Tablo 1) her örnek için ekleyin ve karıştırarak hafifçe vur. O zaman, proteinler elute 4 ° c 20 dk için kuluçkaya.
    9. Her örnek 6 × SDS-sayfa yükleme arabellek (Tablo 1) ile karıştırın. Sonra bir ısı blok için 10 dk. içinde 100 ° C'de tüpler kuluçkaya
    10. Santrifüj 12.000 x g boncuk cips için 1 dakika için. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve örnekleri 1,5 ml mikro-santrifüj tüpleri için transfer. Western blot tarafından analiz veya daha sonra kullanmak için-20 ° C'de depolanan örnekleri.

3. Western Blot

  1. immunoprecipitation yük veya % 4-20 degrade SDS-sayfa jelleri üzerine önceki adımlardan gelen elde edilen örnekler aşağı çekin. Elektroforez 120 V proteinler ayırmak 90 dk için kuralları.
  2. Transfer proteinler jel bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran tarafından electroblotting vasıl 300 mA tank aktarım yöntemini kullanarak 4 ° C'de 90 dk için. Oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabellekte PVDF membran engellemek.
  3. Incubate membran ile birincil antikor antikor seyreltme arabelleği % 3 sığır serum albumin (BSA) (Tablo 1) içeren bir 4 ° C'de gecede Birincil antikorlar için bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikor) veya 1:2000 (anti-Rb ve anti-tübülin antikorları) veya 1:5,000 (anti-GFP ve anti-O'nun antikor) bir seyreltme kullanın.
  4. Yıkama membran 3 x 10 dk 1 x tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ile ara (TBST) tampon (Tablo 1) kullanarak her zaman için. Membran türler belirli Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar seyreltilmiş 1:5,000 %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabelleği ile kuluçkaya. Membran 3 yıkama x 10 dk 1 x TBST tampon kullanarak her zaman için.
  5. Membran çözüm çalışma gelişmiş Kemiluminesan ile (ECL) kuluçkaya. Plastik wrap ile membran kapak ve sinyal gücüne bağlı olarak X-ray film maruz kalmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre döngüsü ilerleme sırasında endojen Rb SUMOylation algılamak için bu çalışma ilk HEK293 hücreleri hücre döngüsü (G0, erken G1, G1, S ve G2/M) beş farklı aşamalarında bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi senkronize. Eşitleme kalitesini nükleik asit leke Akış Sitometresi Analizi (şekil 1) tarafından takip propidium iyodür kullanılarak doğrulandı. Daha sonra hücreleri toplanmış ve RIPA arabellek denaturing tarafından lysed. SUMO proteaz inhibitörü, N-Ethylmaleimide, 20 mM yerli SUMO sinyal deneyler sırasında korumak için son bir konsantrasyon eklenmiştir. Sonra immunoprecipitation denaturing kovalent olmayan belirsiz etkileşim ve bir anti-SUMO1 antikor kullanarak aşağıdaki western blot engellemek için koşullar altında endojen Rb türlerin SUMO sinyal varlığı özellikle de algılandı erken G1 evresi (Şekil 2). Her ne kadar küresel SUMOylation S/G2/M aşamasında zaman noktası, Rb SUMOylation adlı, geliştirilmiş oldu (Şekil 2, giriş paneli) değişiklik olmamıştı. Bu bulgu Rb SUMOylation sade bir şekilde değiştirilmiş küresel SUMO konjugasyon faaliyet sonucu olmadığını göstermektedir. Böylece, bu makalede açıklanan analiz protein immunoprecipitation ve Western blot aşağıdaki sonuçları gösterir SUMOylation endojen Rb protein tespiti için izin verir.

Rb protein, oluşturulan bu çalışmada zorla SUMOylation algılamak için bir kurucu SUMOylated Rb oluşturmak Ubc9, onun C-terminal verimli ve seçici SUMOylation, Rb için (şekil 3A) izin vermek için tek SUMO E2 ligaz eritme tarafından. Ubc9, C93S, işlev kaybı mutasyon aynı zamanda C-Terminal bir denetimi (şekil 3A) hizmet için Rb, eritilmiş olan. Daha fazla SUMO-Rb sinyal özgüllük güçlendirmek için Ubc9 yalnız olmayan erimiş de inşa edildi. 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA arabelleği lysed önce O'nun öğesini Plazmid dört 48 h HEK293 hücre içine transfected. Tüm proteinler sonra tahlil, yıkmak için bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi tabi tutuldu. Eluted Rb proteinler Western blot tarafından analiz edildi. Ubc9 fusion yönetmen-Ubc9 arızalı mutasyon, C93S, bu sinyali üretmek başarısız oldu, ancak Rb SUMOylation bir anti-SUMO1 antikor (şekil 3B, SUMO1 paneli), kullanarak tespit edildi. Not bile daha yüksek molekül ağırlıklı Wataha götürür Ubc9-füzyon tarafından neden olduğu yüksek verimli SUMO değişikliği doğrudan Rb antikor kullanarak tespit edilebilir ve SUMO sinyal (şekil 3B, Rb paneli) karşılık gelir. Ayrıca, Ubc9 yalnız herhangi bir SUMO konjugasyon daha fazla Rb özel SUMOylation (şekil 3B) teyit neden olmadı.

SUMO1 Rb protein11720 lizin Birleşik çünkü Rb SUMOylation daha ileri düzeyde çözümlemek için bu çalışmada bir SUMO-eksik mutasyon bir arginin (K720R) ile bu lizin kalıntı değiştirerek oluşturulur. SUMO-fiil iki geçici ifade Rb proteinlerin algılama kolaylaştırmak için bir GFP-SUMO1 yapısı hücre içi SUMO sinyal artırmak için eklendi. Etiketli onun yaban türü veya mutant Rb HEK293 hücrelere GFP-SUMO1, tahlil ve Rb-SUMO1 fiil yeteneği analiz aşağı çekme ardından birlikte ortak transfected. Gibi K720R mutant Rb Rb SUMOylation (şekil 4) tespit etmek için önerilen yöntemin yeteneği daha da güçlendirilmesi, SUMO modifikasyonu tamamen kaldırıldı.

Figure 1
Resim 1: Hücre döngüsü eşitleme tahlil Akış Sitometresi tarafından doğrulanmasını. HEK293 hücreler kültürlü ve G0, erken G1 G1, S ve G2/M aşamaları hücre döngüsünün bu protokol için açıklanan senkronize. Hücre döngüsü Dağılımları (FACS) sıralama Floresans aktif hücre tarafından belirlenmiştir. Kantitatif analiz FACS testin bir örneği temsil veri gösterilir (n = 1). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Rb's SUMOylated erken G1 aşamasında. HEK293 hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında bu protokol için açıklandığı gibi senkronize. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Giriş denetimleri üzerinde bir % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel dolu, transfer ve anti-SUMO1 ve anti-tübülin ile belirtildiği şekilde deyimiyle. Kalan hücre lysates sonra 1: 200 bir dilüsyonu anti-Rb antikor kullanılarak immunoprecipitation tabi tutuldu. Elde edilen eluents % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve anti-SUMO1 antikor ve anti-Rb antikor kullanarak immunoblotted tarafından ayrı kaldık. Bu deney ile aynı sonucu iki kez tekrarlandı. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Rb-Ubc9 füzyon protein SUMO modifikasyonu tespiti. Ubc9 fusion Yönetmen: SUMOylation (UFDS) yapıları, Rb. (B) kurucu SUMOylation, UFDS tarafından neden olduğu Rb,(a)diyagramı. HEK293 hücreleri geçici onun etiketli UFDS yapıları ile transfected RIPA arabelleği 20 mM N-Ethylmaleimide ile lysed. Her örneği lysate toplam O'nun öğesini Rb-Ubc9 füzyon protein veya (negatif kontrol kullanılan), Ubc9 sırasıyla aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe. Saf protein % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve immunoblotted anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar tarafından ayrı kaldık. O'nun-Rb: Rb-Ubc9 füzyon protein 6XHis öğesini; O'nun-Ubc9: 6XHis Ubc9 sadece etiketledi. RB-Ubc9: değiştirilmemiş Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-sorun-Ubc9: hiper fosforile Rb-Ubc9. Şekilde gösterilen üç bağımsız denemelerin temsilcisi sonuçlarıdır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Rb SUMOylation SUMO-eksik K720R mutasyon azaltır. HEK293 hücreleri geçici işbirliği GFP-SUMO1 birlikte vahşi türü veya mutant Rb-O'nun yapıları ile transfected. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Lysates küçük bir bölümünü doğrudan Western tarafından analiz edildi leke giriş denetimi. Lysates kalan bu protokol için açıklandığı gibi O'nun öğesini Rb proteinler aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe ve anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar ile immunoblotted idi. Rb 720, lizin arginin mutasyon tot NotAlly bu proteinin SUMO modifikasyonu onuntemsilcilerini yasakladı Deneme bir kez buna benzer bir sonuç daha önce11rapor ile yapılmıştır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

ÇözümBileşenleriYorumlar
RIPA lizis arabellek50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; % 1 NP-40; % 1 sodyum deoxycholate; %0.1 SDSProteaz inhibitörü kokteyl ve N-ethylmaleimide kullanımdan hemen önce ekleyin.
Yıkama arabellek50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 20 mM imidazoleSadece tahlil çekme için kullanılan
Elüsyon arabellek50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 250 mM imidazoleSadece tahlil çekme için kullanılan
Arabellek yükleme x 60,5 M Tris, pH 6.8; = % 30 gliserol; % 10 SDS; %5 β-mercaptoethanol; %0.1 bromphenol maviMağaza-20 ° c
Arabellek çalıştıran x 100.25 M Tris, pH 8,6; 1.9 M glisin; % 1 SDS1 x çalışan tampon yapmak için: 100 ml 10 çalışan arabellek x 900 mL GKD2ile O karıştırmak
10 x Aktarım arabellek0.25 M Tris, pH 8.3, 1.9 M glisin1 x Aktarım arabellek yapmak için: 100 mL 10 x 200 ml metanol ile Aktarım arabellek ve 700 mL GKD2O karıştırmak
10 x TBS arabellekGKD2O: 24,08 g Tris pH 7.4 1 L içinde; 80 gr NaCl1 x TBST tampon yapmak: 900 mL GKD2O ve ara-20 1 mL 100 mL 10 x TBS arabellek karıştırın
Arabellek engelleme%1 5 yağsız kuru süt ile x TBSTArabellek kullanımdan hemen önce hazırlamak
Antikor seyreltme arabellek1 ile %3 BSA ve %0.02 sodyum azid x TBSTBu arabellek 4 ° C'de en az 6 ay için saklanan olabilir

Tablo 1: Çözümler ve arabellekleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu kağıt algılayabilir ve Rb endojen SUMOylation insan hücrelerinde çözümlemek için bir protokol açıklar. Bu yöntem özellikle küresel sinyal SUMO ile ilgili herhangi bir değişim olmadan endojen Rb protein üzerinde duruldu gibi Rb-SUMO değişiklik tamamen doğal fizyolojik koşullar altında soruşturma için önemli bir araçtır.

Bu amaca ulaşmak için unutmayın ki bu: 1) SUMO dört izoformlarının (SUMO1-4, her farklı genler tarafından kodlanmış) ubiquitination ile karşılaştırıldığında kapsar rağmen SUMO türler daha az bol; 2) çoğu SUMO hedef proteinler için verilen bir protein yalnızca küçük bir bölümünü sabit devlet, SUMO konjugasyon ilgili enzimler arasında sürekli rekabet sonucu ve14,21deconjugation SUMOylated olduğunu; ve 3) SUMO hedefler SUMOylation ve deSUMOylation hızlı döngüleri tabi. Örneğin, son veri geçerli bu kağıt yazarlar tarafından elde Rb-SUMO1 sadece SUMOylation13 tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreç olduğunu anlayışı ile tutarlıdır erken G1 aşamasında zaman çok kısa bir pencere için var olduğunu göstermek . Tüm bu gerçekler doğrudan verilen bir protein endojen SUMOylation tespit etmek zor olsun. Böylece, başarılı bir şekilde bu algılamak için kesin şartlar altında bu değişiklik oluşur tanımlamak önemlidir. Örneğin, önerilen bu protokol için hücre döngüsü Eşitleme zamanlaması Rb SUMOylation tespiti için çok önemlidir. En iyi duruma getirilmiş deneysel bir işlem için verilen bir protein alt düzey SUMO-modified tür algılama başarılı da önemlidir. Örneğin, uygun sonication veya geçen aracılığıyla iğneler yapışkan ve yapışkan bileşenleri genomik DNA nedeniyle oluşumu engelleyebilir, böylece uygun sonication toplam protein ayıklama kolaylaştırabilir. Ayrıca, hedef protein yüksek afinite ile iyi bir Monoklonal antikor miktarı ve immunoprecipitation özgüllüğü artırmak için yardımcı olabilir. Özet olarak, önerilen yöntem daha da altında endojen Rb SUMOylated, hangi aşağıdaki overexpression tabanlı fonksiyonel testin öncül olduğunu fizyolojik şartlarda keşfetmek için önemlidir.

Belirli bir protein SUMO sinyal yükseltmek için co-overexpress yanı sıra diğer SUMO kaynaklı proteinler (genellikle Ubc9 ve SUMO protein) hücrelerde bu protein için yaygındır. Bir antikor substrat karşı kullanarak basit bir Western blot daha yüksek molekül ağırlıklı, bu proteinin SUMOylated formu bulmak için en kolay yolu olsa da, biz bu yöntemle SUMO-Rb sinyali algılamak başarısız oldu. Böylece, bu kağıt sadece zarlarını eksojen Rb protein SUMO değişimini algılamak için bir yöntem üzerinde duruldu. Ayrıca, bu yöntem nasıl yapay olarak geliştirmek veya SUMO-konjugasyon Rb, ortadan kaldırmak için nitelendirdi. Tek E2 ligaz doğrudan SUMO belirli hedefleri22' ye aktarmak için Ubc9 bulundu. Böylece, Rb C terminaline eritme tarafından Ubc9 önemli ölçüde SUMO-modifikasyonu Rb. bu yöntemi kullanarak teşvik etmektedir, bu kağıt yazarlar başarıyla Rb SUMOylation yeterince onun bağlama artırarak kendi fosforilasyon terfi gösterdi CDK213için. Ayrıca, Rb SUMOylation kaybı fonksiyonel sonuçları çalışmaya, daha önce bildirilen11bir SUMO-eksik Rb yapı yazarlar oluşturulan. Bu geçerli raporda önerilen yöntem kullanarak, bu SUMO-Rb normal hücre döngüsü ilerleme ve Hücre proliferasyonu13için gerekli olduğunu gösterilmiştir.

SUMO1 ek olarak, SUMO2 ve SUMO3 aynı zamanda protein SUMOylation14,17önemli rol oynarlar. Çünkü onlar yakından ilgilidir ve % 97'si kimlik paylaşmak SUMO2 ve SUMO3 SUMO2/3 anılır. SUMO1% 50 benzerlik SUMO2/3 ile paylaşır. Bu yaygın olarak SUMO-2/3 ağırlıklı olarak hücre stres yanıt-e doğru15,17,23' te, söz konusu ise SUMO1 normal hücre fizyolojik fonksiyonları ve bakım, sorumlu olduğunu kabul edilir 24. Rb da bilinmeyen fonksiyon12ile SUMOylated SUMO2/3 tarafından olabilir olduğunu göz önüne alındığında, bu çalışmada önerilen yöntem hala algılama ve Rb bu değişiklik analizi için uygundur. RB ek olarak, yöntem tanımlamak burada yaygın olarak algılama ve hedef proteinler çeşitli SUMOylation fonksiyonel analiz için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada bilim ve teknoloji Komisyonu Shanghai (Grant No. 14411961800) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (Grant No. 81300805) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
ThymidineSigmaT9250
NocodazoleSigmaM1404
propidium iodideThermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
RNase A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-EthylmaleimideSigmaE3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)AMRESCOM107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)AMRESCOM158
protease inhibitorRoche5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb antibodyCell Signaling Technology#9309
Protein A/G-Sepharose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose BeadsQiagen30230
ImidazoleSigmaI0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) MembraneMilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
Tubulin antibodyAbmartM30109
SUMO1 antibodyThermo Fisher Scientific33-2044
GFP antibodyAbmartM20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) KitThermo Fisher Scientific32106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  2. Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer.Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
  3. Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control.Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
  4. Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression.Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
  5. Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
  6. Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
  7. Hilgendorf, K. I., et al.The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
  8. Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
  9. Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
  10. Ezhevsky, S. A., et al.Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
  11. Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
  12. Li, T., et al.Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
  13. Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
  14. Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on.Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
  15. Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
  16. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
  17. Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
  18. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
  19. Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
  20. Jakobs, A., et al.Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
  21. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  22. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  23. Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
  24. Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).

Introduction

Retinoblastoma1 (RB1) geninde germline mutasyonu olan hastalar, ikincil kansere yakalanma açısından yüksek riske sahiptirler. Bu risk radyoterapi görenlerlerde artar. Bu nedenle RB gen mutasyon analizine göre değerlendirilen tedavi yaklaşımları ikincil kanserler açısından riski azaltmak açısından büyük önem taşımaktadır. Eskiden eksternal ışın radyasyon terapisi (EBRT) ya da enükleasyon retinoblastomalı hastaların tedavisinde kullanılan tanımlı tedavi metodları olarak bilinmekteydi. Ancak EBRT katarak, optik nöropati ve ikincil maliniteler gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilmektedir. Sağkalımı artırmak, komplikasyonları önlemek ve gözün görme yetisini korumak amacı ile EBRT ve enükleasyon tedavilerine alternatif başka yöntemlerin denenmesi gündeme gelmiştir.[1] Özellikle yüksek riskli retinoblastoma hastalarında kemoterapi gerek sistemik kontrol açısından, gerek intraoküler tümörü küçülterek lazer fitokoagülasyon, termoterapi ve kriyoterapi gibi fokal oftalmik tedavilere olanak sağlaması ve böylelikle görmenin korunması açısından yararlıdır.[2,3] Son yıllarda Melphalan ve diğer kemotöropatik ajanlarla uygulanan intraarteriyal kemoterapi (IAC) RB tedavisine yeni bir uygulama getirmiştir. IAC, sistemik kemoterapi ve fokal tedavilerin başarısız olduğu durumlarda ikinci tedavi alternatifi olarak denenmiş ve son zamanlarda bazı olgularda ilk tedavi yaklaşımı olarak kabul görmüş ve kullanılmaya başlanmıştır.[4,5]

Retinoblastoma geni retinoblastoma olarak adlandırılan çocukluk çağı kanserlerinde mutasyona uğramış tümör baskılayıcı bir gendir.[6] RB geninin keşfinden sonra bu genin birçok kanserde inaktif olduğu gösterilmiştir. Retinoblastoma tümör baskılayıcı gen yolağı, birçok kanserde mutant haldedir. Retinoblastoma tümör baskılayıcı proteini (pRb) G1-S geçişinde kontrol noktası olarak rol oynamaktadır. pRb’nin posttranslasyonel modifikasyonlarla düzenlenmesinin kritik olduğu düşünülmektedir. pRb, siklin bağımlı kinazlar (CDKs), p38 MAP kinaz, Chk1/2, Abl ve Aurora B gibi farklı birçok kinaz tarafından fosforile edilmektedir. Fosforilasyonun yanında, pRb asetilasyon, metilasyon, ubikitinasyon ve SUMOlasyon ile de uyarılabilmektedir. Asetilasyon, metilasyon ve SUMOlasyon gibi modifikasyonlar pRb aracılı gen susturulmasında rol oynamaktadırlar. pRb’nin ubikitinlenmesi ise degredasyon ve apoptozun düzenlenmesinde kullanılan modifikasyonlardır. Son dönemlerde yapılan proteomik araştırmalarından edinilen bilgiler pRb’nin posttranslasyonel modifikasyonunun daha önce düşünülenden çok daha kapsamlı olduğunu göstermektedir. Bu yeni bilgi birçok bilinmeyen yolağın da pRb’nin düzenlenmesini etkilediğini desteklemektedir.[7] RB gen ailesine mensup RBp107 ve RBp130 RB proteinleri G0/G1 fazında E2F transkripsiyon faktörünü inhibe etmektedirler. Mitojenik sinyallere karşı, CDKs RB gen ailesi üyelerini fosforile etmekte ve RB aile üyeleri ile E2F arasında oluşmuş olan kompleksin yıkımına yol açmaktadırlar. Buna bağlı olarak S fazı için gerekli genlerin transkripsiyonu sağlanmakta ve S fazı gerçekleştirilmektedir. Hücre döngüsündeki rolünün ötesinde, RB gen aile üyeleri, DNA replikasyonu, mitoz, kromatin yapısı, hücre metabolizması, hücresel farklılaşma ve hücre ölümü gibi fonksiyonları da düzenlemektedirler.[8] RB proteininin yanında RB ilişkili diğer iki protein olan p107 ve p130 proteinleri cep proteinleri olarak adlandırılmaktadırlar. RB proteinlerinin aktivitesinin düzenlenmesinde fosforilasyon anahtar role sahiptir. RB proteini hücre döngüsü süresince SiklinD/cdk4/6, SiklinE/cdk2 ve SiklinA/cdk2 kinazları ile fosforile olan çeşitli fosforilasyon bölgelerini taşımaktadır. RB’nin biyolojik fonksiyonları tümör baskılanması, hücre döngüsünün düzenlenmesi ve apoptozu içermektedir. RB’nin bu fonksiyonları çok sayıda hücresel protein ile etkileşim sonucu gerçekleşmektedir. Yüzden fazla proteinin RB proteini ile etkileşime girdiği rapor edilmiştir.[9]

Retinoblastoma gen yolağında CDKN (Ink4a), D tipi siklinler, siklin bağımlı protein kinazlar (cdk4, cdk6), RB cep proteinleri ailesi (RB, p107, p130) ve E2F transkripsiyon faktör ailesi (E2F1- 8’in heterodimerleri, DP1 ve DP2) olmak üzere beş protein ailesi yer almaktadır. Bu yolak büyümeyi baskılayıcı sinyallerin yanı sıra, büyümeyi uyaran sinyaller ile onun bileşenlerinin aktive olması ya da inhibe olması ile hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde merkezi rol oynamaktadır. RB gen yolağının p16Ink4a, siklin D1 ve RB1 geni gibi bileşenleri farklı yapısal farklılıklara uğramaktadır. p16Ink4a lokusunun delesyonu ya da sessizleştirilmesi, siklin D1 odağının amplifikasyonu ve RB1 geninin bialelik mutasyonu farklı farklı birçok kanser hücresinde bozulmuş durumdadır.[10] RB gen yolağının bu bileşenleri kanser tedavisinde kullanılabilecek hedefler olarak görülmektedir. Bu gen yolağındaki beş farklı protein ailesi arasında fonksiyonel etkileşimler söz konusudur. Ink4a protein ailesi; p16Ink4a, p15Ink4b, p18Ink4c, p19Ink4d, AKN domainini içeren küçük sabit ısılı proteinlerdir. Ink4 proteinlerinin her biri cdk4 ve cdk6’ya bağlanarak bu siklin bağımlı kinazların aktivitelerini inhibe etmektedirler. Cdk4/6, siklin D bağımlı protein kinazlardır. Siklin D proteinlerinin her biri cdk4 ya da cdk6 ile etkileşime girerek aktif kinaz kompleksini oluşturmaktadır. Ink4 proteinleri, cdk4/6 için aktif kinaz kompleksinin oluşumunu engellemek amacıyla siklin D ile yarışmaktadır. Hücre proliferasyonu süresince siklin D/cdk4/6 kompleksi, hücrenin mitojenik sinyallere tepki vermesiyle hücre döngüsü başlatıldığında aktive olmaktadır. SiklinD/cdk4/6 kompleksinin hücredeki ana hedefi RB cep protein ailesidir. Bu RB cep proteinleri ailesi kromatin yapılarını ve transkripsiyon faktör aktivitelerini düzenlemek için çoklu peptid bağlayıcı cepler ve birleştirici nükleer protein komplekslerini içermektedir. RB cep proteinlerinin SiklinD/Cdk4/6 ile fosforilasyonu sonucu RB-E2F etkileşimi ortadan kalkmaktadır. E2F, hücre döngüsünün progresyonuna (Siklin E ve Siklin A), nükleotid biyosentezine (timidilat sentetaz ve ribononükleotid redüktaz), DNA replikasyonuna (MCM7 ve cdc6) ve mitotik progresyona (Siklin B1 ve cdk1) neden olan birçok genin promotörüne bağlanır ve onların aktivitelerini düzenlemektedir. Ayrıca E2F proapoptotik genlerin ekspresyonunu uyarmakta ve böylece RB gen yolağındaki değişimler sitotoksik ajanlara tepki olarak tümör hücresini etkilemektedirler.

E2F Transkripsiyon Faktörleri
Memelilerde en az üç çeşit E2F transkripsiyon faktörleri vardır. Aktive edici E2F’ler arasında E2F1, E2F2, E2F3 transkripsiyon faktörleri en iyi bilinenleridir. Bu transkripsiyon faktörleri, RB gen yolağında hücre döngüsü ile ilgili olan genlerin transkripsiyonu ile inaktif hale dönüştürüldüklerinde S fazına girişi sağlarlar. Baskılayıcı E2F proteinleri olan E2F4 ve E2F5 ise, RB aile üyeleri ile bir kompleks içinde olan E2F hedef genlerinin transkripsiyonlarını baskılamaktadır. E2F proteinlerinin üçüncü kategorisinde yer alan E2F6, E2F7 ve E2F8 transkripsiyon faktörleri E2F hedef gen ekspresyonunu baskılamakla birlikte RB bağlanmasından bağımsız bir fonksiyona sahiptirler.[11] E2F transkripsiyon faktörlerinin birçok hücresel aşamada rol aldığı çok sayıda mikroaray çalışması ile kanıtlamıştır.[12] E2F transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenen, apoptoz ve DNA hasarını kontrol eden genler olmak üzere farklı kategoride birçok gen bulunmaktadır (Şekil 1). E2F tarafından düzenlenen ve bugün birçok kanserde etkili olduğu bilinen bir başka gen grubu ise Ras yolağındaki genlerdir.[13]

Sekil 1: E2F hem büyüme artışına neden olan genler hem de büyüme baskılayıcı genleri düzenler. E2F hedef genlerinin ekspresyon düzeyleri ile hücre kaderinin belirlenmesindeki dengeyi sağlar.

Retinoblastoma Protein Ailesinin Hücre Proliferasyonundaki Rolü
Retinoblastoma, hücre döngüsünün S fazına girişinde anahtar inhibitör olarak görev almakta ve bu yolla hücre proliferasyonunu düzenlemektedir. RB protein ailesi, G1 progresyonu, S fazına giriş ve hatta mitozdan çıkış gibi hücre döngüsünün diğer aşamalarını da düzenleyici bir role sahiptir. RB protein ailesinin hem E2F’ye bağlı hem de bağımsız olarak etkili olabilmektedir. RB protein ailesi G1 progresyonu boyunca ekspresyon düzeylerinde farklılık gösterirler.[14] G1’in erken fazında p130 ve p107 yüksek seviyede eksprese edilmekte ve bu proteinler baskılayıcı E2F’ler ile ilişki içinde görevlerini sürdürmektedirler. Gen ekspresyonunun baskılama görevi olan baskılayıcı E2F’ler gen ekspresyonunu baskılamak için RB protein ailesine ihtiyaç duymaktadırlar.[15]

Retinoblastoma Protein Ailesinin Apoptozdaki Rolü
Retinoblastoma proteini, hücre döngüsünü düzenlemesine ek olarak, apoptoz gibi hücre ve organizmanın diğer fonksiyonlarını da düzenler. RB, apoptoz düzenleyicilerin ekspresyonlarının kontrolü ile apoptozu direkt düzenleyebildiği gibi hücre döngü progresyonunu düzenleyerek indirekt olarak da bu düzenlemeyi yapabilmektedir. RB gen yolağı ayrıca proapoptotik faktörlerin transkripsiyonel düzenleyicisi olarak da apoptozu düzenleyebilmektedir. E2F1 aşırı ekspresyonu proapoptotik genler olan Arf, p73, APAF-1, Smac/ Diablo ve Omi HTRA2 gibi genlerin transkripsiyonel aktivasyonuyla apoptoza neden olmaktadır. [16,17] E2F, ARF ve PIN gibi proteinlerin düzeylerini artırarak p53 proteininin stabilizasyonu yoluyla apoptozu düzenleyebilmektedir.[17] RB/E2F proteinleri ile proapoptotik hedef genlerin ekspresyonlarının düzenlenmesi diğer düzenleyiciler ve sinyal yolakları ile yürütülür. Örneğin GABP direkt E2F1 ile bağlanır ve özellikle E2F1 bağımlı apoptozu inhibe eder.[18] Ayrıca DNA hasar sinyalleri RB proteininin asetilasyonuna neden olur ve E2F1’e bağlanmasını engelleyerek E2F1’in proapoptotik aktivitesini etkinleştirir (Şekil 2).[19,20]

Sekil 2: Retinoblastoma proliferasyon, apoptoz ve farklılaşma sinyallerinde temel aracıdır. Retinoblastoma, EID ve ID2 farklılaşma inhibitörlerinin downregülasyonu ile farklılaşmayı düzenler. Retinoblastoma aktivatör- E2F’leri inhibe ederek hücre döngüsü progresyonunu engeller. p107 ve p130, baskılayıcı E2F’leri ayarlayarak hücre döngüsünden çıkışı sağlar. E2F1’in deregülasyonu ise apoptoza neden olur.

Retinoblastoma Protein Ailesinin Farklılaşmadaki Rolü
Retinoblastoma yolağı gelişmiş organizmalardaki hücrelerin farklılaşmasında önemlidir. Gelecekteki kanser terapilerinin tümörün büyümesini durdurabilmesi, farklılaşma yolaklarının tekrar aktif hale getirilebilmesi ile başarılı olacağı düşünülmektedir. Bu yolla tümör hücreleri farklılaşma ve proliferasyonu durdurabilirler. RB yolağının farklılaşmanın düzenlenmesindeki rolünün anlaşılması bize kanser hücrelerinde farklılaşmanın tamamlanması ve proliferasyonun bloklanması için yeni hedefler sunacaktır.

Retinoblastoma yolağının memeli hücrelerinde farklılaşmayı düzenlediğine ilişkin bilgiler mevcutsa da RB’nin farklılaşmadaki rolü hücre döngüsünden çıkışı düzenlemesi ile ilgilidir. RB gen fonksiyonu olmayan hücrelerin, hücre döngüsünden çıkamadığı ve farklılaşmayı sonlandırana kadar proliferasyona devam ettiği gözlenmektedir. Örneğin RB geni olmayan hematopoetik sistem hücreleri tam olarak farklılaşamamakta ve durum miyeloproliferatif hastalıkların gelişimine neden olmaktadır. Bu hastalıklar da öncül hücrelerin sayısının artmasına ve daha fazla tümör oluşumuna neden olmaktadırlar.[21] RB geni bulunmayan osteoblastların hücre döngüsünden çıkışta problem yaşadıkları görülmekte ve bu durum da RB’nin hücre farklılaşması ve hücre döngüsü çıkışı arasındaki bağlantı için gerekli olduğunu kanıtlamaktadır.[22] Bu sonuçlar, RB’nin hücre döngüsünün çıkışını ve farklılaşmış hücrelerin pasif durumunu dengelemekte önemli role sahip olduğunu destekler niteliktedir.

Kanser Hücrelerinde Retinoblastoma Gen Yolağındaki Değişiklikler
Kanser araştırmacıları kanser hücrelerinde hücre proliferasyonuna neden olmasından dolayı RB gen yolağıyla ciddi şekilde ilgilenmişlerdir. Bu yolakta Ink4 ailesi ve RB protein ailesinin fonksiyonu tümör baskılayıcı durumdayken; Siklin D, cdk4/6 ve E2F protein aileleri tümör hücresinin proliferasyonu yönünde etki etmektedirler. 206 primer glioblastoma tümörü üzerinde yapılmış kapsamlı genom ve transkriptom analizi çalışmasında, RB yolağının primer glioblastoma örneklerinde değiştiği görülmüştür.[23] Bu sonuçlar da kanser hücrelerinde, RB yolağının değişiklikler gösterdiğinin kanıtı olarak değerlendirilmektedir.

Kanser Terapisinde Retinoblastoma Gen Yolağı
Retinoblastomanın kanser hücrelerinde en az üç farklı fonksiyonu bulunmaktadır. Kanserlerin birçoğunda RB yolağı, ya RB geninin mutasyonu veya delesyonuyla ya da onun fonksiyonel inaktivasyonuyla etkisiz hale getirilmektedir. RB gen fonksiyonunun kazanıldığı çok az sayıda kanser tipi bulunmaktadır. RB yolağının durumuna bağlı olarak kanser hücrelerine özel hedeflerin kullanıldığı farklı stratejiler geliştirilebilir. RB yolağındaki RB, E2F, siklin D, Cdk4/6, p16Ink4a (CDKN2A) bileşenleri ve onların fonksiyonel etkileşimleri kanser tedavisinde hedef olarak kullanılmalarına neden olmuştur. RB yolağındaki genetik ve epigenetik değişiklikler birçok sporadik kanserlerde saptanmıştır. RB yolağının durumu radyasyon ve genotoksik ilaçlara tepki veren tümör hücrelerini etkilemektedir. Bu durum hücre döngüsünün siklin D1 degradasyonu aracılığı ile durdurulmasına ve böylece RB defosforilasyonuna neden olmaktadır. RB yolağının durumu, tümör hücresinin hormon ve mitojenik sinyalleri bloke eden diğer töropatik stratejilere tepkisini etkilemektedir. RB yolağındaki hasarlar E2F aktivitesinin deregülasyonuna sebep olmakta ve bu durum G1-S geçişini ve apoptozu destekleyerek gen ekspresyonunu uyarmaktadır (Şekil 3). Potansiyel töropatik stratejiler RB yolağındaki bu hedefleri direkt hedef almaya yöneliktir. [24] Kanser için ilaç geliştirmeyi amaçlayan birçok araştırma apoptozu uyarma üstüne odaklanmıştır.

Sekil 3: Retinoblastoma, E2F, D-siklinleri, Cdk4/6, p16Ink4a(CDKN2a) gibi RB yolağı bileşenleri ve onların fonksiyonel etkileşimleri diagramda gösterilmiştir. Retinoblastoma yolağındaki genetik ve epigenetik değişimler birçok sporadik kanserlerde tanımlanmıştır ve bu defektler diagramın sağ üst köşesinde yer alan mor kutucukta özetlenmiştir. Retinoblastoma yolağının durumu tümör hücresinin radyasyona ve genetoksik ilaçlara tepkisini etkiler ve siklin D1 degredasyonu ve sonucunda RB defosforilasyonu ile hücre döngüsü arrestine sebep olur. Retinoblastoma yolağının durumu, hormonlar ve mitojenik sinyalleri bloke eden diğer teröpatik stratejilere karşı tümör hücresinin tepkisini etkiler. Retinoblastoma yolağındaki bir defekt E2F aktivitesinin deregülasyonuna sebep olur ve G1-S geçişi ve apoptoz için gen ekspresyonunu uyarır.

Diğer uygulanabilir seçenekler hücre proliferasyonunu inhibe etmek, hücresel senesense neden olmak ya da farklılaşma yolaklarını yeniden aktifleştirmek ve böylece hücrenin farklılaşmasını ve proliferasyonunu durdurmayı sağlamak olarak sıralanabilir. RB’nin geri dönüşümsüz inaktivasyonu olmadığı kanserler için, tümör oluşumunu engellemek açısından RB fonksiyonunu yeniden aktif hale getirmek olası bir çözüm gibi görülmektedir. Fakat özellikle hücre tiplerini ve hücresel içeriklerini tamamıyla anlayabilmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Farklılaşmanın düzenlenmesinde RB gen yolağının rolünün anlaşılması bizlere kanser hücrelerinde farklılaşmanın ve proliferasyonun bloke edilmesi açısından uygulanabilir bir hedef sunacaktır.

Retinoblastoma Gen Mutasyonları ve Retinoblastoma
Retinoblastoma1 geni 13. kromozomun q14.2 bandında, 27 eksona sahip yaklaşık 200 kb’lık alan kaplayan bir gendir. RB1 geninin kalıtsal yatkınlık oluşturma mekanizması bi-alelik inaktivasyon ile gerçekleşmektedir. Bugüne kadar RB1 geninde 900’den fazla mutasyon tanımlanmıştır.[25] Bu mutasyonların genin herhangi bir bölgesindeki CpG adalarında gerçekleştiği gösterilmiştir.[26] RB gen mutasyonları retinoblastoma ve bu hasta grubunda oluşan sekonder kanserler ile sporadik akciğer, meme ve diğer birçok malinitede gösterilmiştir. [27-29] RB1 gen mutasyonlarının görülmediği kanser türlerinde ise pRB’nin inaktive olduğu gözlenmiştir. Bu da RB1 geninin kanser biyolojisinde son derece önemli bir rol oynadığını kanıtlamaktadır. [30] RB1 genindeki mutasyonların saptanmasında genin büyük oluşu, mosaizism, mutasyonel heterojenlik, mutasyonların kodlanmayan bölgelerde oluşu gibi birçok zorlukları mevcuttur.[31] Bununla beraber bu gendeki mutasyonların taranmasında quantitative multiplex PCR, sequencing, denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) ve quantitative multiplex PCR for short fluorescent segments (QMPSF) assay gibi birçok farklı metod kullanılmakta ve bu metodların belirleme gücü %89-92 arasında değişmektedir.[32-

SummaryIntroductionReferences

nest...

191003 191004 191005 191006 191007

batman iftar saati 2021 viranşehir kaç kilometre seferberlik ne demek namaz nasıl kılınır ve hangi dualar okunur özel jimer anlamlı bayram mesajı maxoak 50.000 mah powerbank cin tırnağı nedir